腦缺血再灌注對血腦屏障緊密連接的影響

葛志強

腦缺血再灌注對血腦屏障緊密連接的影響

葛志強

血腦屏障（BBB）是機體內重要的防御結構之一，其能夠限制水溶性及大分子脂溶性物質進入大腦，調節水、離子及大分子物質的轉運，從而維持大腦內環境系統的穩定［1，2］。血腦屏障的構成包括：血管內皮細胞、內皮細胞間的緊密連接、基底膜以及星形膠質細胞足突。血管內皮細胞間的緊密連接（TJs）是血腦屏障維持結構與功能的重要基礎。本文對腦缺血再灌注對血腦屏障緊密連接的影響綜述如下。

1 緊密連接的分子構成

1.1 閉合蛋白（Claudin） Furuse等［3］1998年發現Claudins-1和Claudins-2，至今已經有至少24種閉合蛋白被發現。其是相對分子質量為22KD的蛋白質，有4個跨膜區域，是緊密連接的主要組成部分［4］。細胞膜外的閉合蛋白與相鄰內皮細胞的閉合蛋白相結合，形成二聚體形式，類似“邦鞋帶”樣結構。閉合蛋白的羧端在細胞質內與ZO-1、ZO-2和ZO-3等胞質附著蛋白相連接。

1.2 咬合蛋白（occludin） 咬合蛋白于1993年被Furuse等［5］在雞中發現，接著在1996年Akatsuka等［6］在哺乳動物中發現。它是相對分子質量為65KD的蛋白質，在氨基酸序列上與閉合蛋白無相似序列。與閉合蛋白一樣，也包括4個跨膜區域，其兩端（1個短的氨基端及1個長的羧基端）均位于胞質內。咬合蛋白在細胞質內的直接與ZOs蛋白相連。在細胞裂隙間兩個相鄰細胞的閉合蛋白和咬合蛋白的胞外區域形成的環形結構相連接，形成緊密連接的細胞旁屏障。正是由于這種特殊結構咬合蛋白對細胞旁的滲透調節起著重要作用［7］。

1.3 連接粘附分子（JAM） 連接粘附分子是跨膜蛋白的一種，Martin-Padura等［8］于1998年發現這類蛋白。屬于免疫球蛋白（Ig）家族的成員，相對分子質量為40KD。其有一個跨膜結構，細胞外的部分由二硫鍵形成了兩個環形。至今為止已經發現了JAM-1，JAM-2和JAM-3三種蛋白，而只有JAM-1和JAM-2在腦血管中有表達［9］。

1.4 胞質附著蛋白 胞質間附著蛋白包括閉鎖小帶蛋白-1、-2、-3（zonula occludens Z0-1、-2、-3）、cingulin、7H6和AF-6等蛋白。Z0-1、-2、-3相對分子質量為220KD、160KD、130KD，有著相似的氨基酸序列，均屬于膜結合鳥苷酸環化酶激活蛋白家族。其有3個PDZ區域（PDZ1、PDZ2和PDZ3），1個SH3區域，一個鳥甘酸激酶（GUK）區域。PDZ結構域主要功能是參與細胞內的信號，細胞粘附，離子運輸，形成細胞間屏障；SH3結構域和Ras蛋白、Src激酶等通過細胞骨架共同調節胞內信號傳導［10］；GUK結構域具有ATP酶活性。閉鎖蛋白富含脯氨酸的羧端與細胞骨架蛋白相連。這樣閉鎖蛋白就充當著連接跨膜蛋白到細胞骨架蛋白的中間蛋白。Cingulin位于細胞質內與ZOs蛋白、肌球蛋白、JAM-1和AF6相連接，因此Cingulin是緊密連接的一種重要的支架蛋白。Cingulin是通過傳導肌動-肌球蛋白細胞骨架產生的收縮力，從而產生調節血腦屏障通透性的功能［11］。

1.5 細胞骨架蛋白 肌動蛋白（Actin）是相對分子質量為42KD，是一種中等大小的蛋白。肌動蛋白的多聚體形成肌動蛋白絲，稱為纖維狀肌動蛋白（F-actin）。肌動蛋白纖維對于血腦屏障緊密連接的穩定性有著重要的作用［12］。

2 腦缺血再灌注對緊密連接的影響

目前有研究表明大鼠腦缺血2h后occludin和Claudin蛋白及相應mRNA的表達開始下降，6h后達到最低，1d后開始升高，而血腦屏障的通透性與此呈負相關性［13］。孫偉等［14］認為缺血2h再灌注3hoccludin mRNA和蛋白的表達水平下調，再灌注24h達到高峰，72h開始減弱，且再灌注過程中occludin沿血管的表達由連續狀態變得間斷、乃至消失。Kago等［15］發現，在人工誘導的大鼠腦栓塞中，occludin和ZO-1的水平在栓塞后下降。吳麗文等［16］透過體外研究發現，缺氧5h后occludin和actin的蛋白表達量無顯著變化，而ZO-1的表達顯著減少。

目前對于缺血后occludin和Claudin表達變化，主流觀點認為是表達下降，雖然下降的時間點有所不同，這可能是由于研究對象或條件等方面不同造成的差異所導致。還有一部分學者認為，血腦屏障通透性的增加，除缺氧后導致的緊密連接蛋白表達的減少，與一些蛋白的位置及結構的改變也有關系。如孫偉等［14］觀察到再灌注過程中occludin沿血管的表達由連續狀態變得間斷、乃至消失。Fischer等［17］發現在缺氧時ZO-1和ZO-2蛋白由原來的細胞質向細胞核內轉移，同時伴隨著細胞旁通透性的增加。

有學者認為缺氧后細胞骨架蛋白的動態重組作用對于血腦屏障的調節有著重要的意義［18］。缺血后細胞質內actin蛋白的總量無明顯變化，1h后在細胞膜檢測到actin數量的上升，而6h后便回到正常水平。Wachtel等［19］發現缺血5h復氧2h后血腦屏障的功能完全恢復，在整個病理過程中主要是F-actin結構發生一系列的變化。

3 腦缺血再灌注導致緊密連接破壞的相關分子機制

3.1 蛋白質磷酸化信號轉導途徑 蛋白激酶C（PKC）在缺血再灌注的情況下對血腦屏障通透性的調節起著重要的作用。PKC同工酶類在血腦屏障中可以調節緊密連接蛋白的組裝也能維持內皮細胞旁的完整性［20］。PKC能使肌球蛋白輕鏈和肌動蛋白磷酸化，從而導致內皮細胞收縮。有實驗證實PKC抑制劑能通過多種途徑降低內皮細胞間的滲透率［21］。

蛋白激酶A（PKA）能夠維持細胞支架絲的穩定性，使肌球蛋白輕鏈去磷酸化，使F-actin從肌球蛋白上分離，以及增強細胞基質連接。PKA還能夠抑制血小板聚集和白細胞粘附［22］，這可能能減輕缺血再灌注過程中炎癥對血腦屏障通透性的不利影響。有體外實驗表明缺血及再灌注導致的微血管通透性增加能被cAMP所逆轉［23］。而cAMP的作用正是通過PKA介導完成的。

蛋白激酶G（PKG）在微血管通透性升高的細胞內信號轉導中是重要的信號分子，其組成的Ca2+-NO-cGMP-PKG級聯反應在微血管通透性的調節中起重要的作用。cGMP誘導細胞內骨架蛋白的應力性變化，繼而增加內皮細胞的通透性。Wong等［24］研究結果顯示，缺血再灌注導致的緩激肽、組胺、NO、TNFα、血小板活化因子、VEGF等的變化，可通過NO-cGMP途徑導致細胞旁通透性的增加。通過抑制PKG可以減輕大腦血管內皮細胞缺氧壓力下所導致的ZO-1 及ZO-2由細胞質向細胞核移位。

酪氨酸蛋白激酶（PTK）是細胞內信號傳導分子，在缺血再灌注時能夠調節內皮細胞旁的通透性。Occludin蛋白跨膜鏈上含有大量的酪氨酸，因此對酪氨酸的磷酸化特別敏感。缺血再灌注可導致細胞內occludin蛋白的磷酸化增加，使其和ZO-1、-2和-3的連接減少，最終導致血腦屏障的破壞［15］。而酪氨酸抑制酶可以減輕occludin磷酸化導致的血腦屏障的破壞以及梗死面積的增加［25］。

3.2 Ca2+信號轉導 Ca2+是體內重要的第二信使，對細胞功能的維持起著重要的作用，細胞內鈣離子水平通過細胞膜鈣通道和鈣泵精確調節到細胞外間隙或者細胞內內質網中。缺血再灌注過程中可引起細胞內Ca2+的增高，ATP減少，以及興奮性氨基酸和NO的釋放。而炎性反應也刺激血管內皮細胞中鈣離子的濃縮［26］，這也許是導致再灌注過程中第二次鈣波動的原因。細胞內鈣濃度的升高主要是激活鈣調蛋白依賴性激酶，細胞內鈣濃度的變化能使ZO-1和肌動蛋白的結合發生變化，并導致occludin在細胞內的分布改變，從而使血腦屏障通透性增加。鈣離子通道阻滯劑也證實了能夠降低因缺血引起的血腦屏障的通透性增加［27］。

3.3 基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性 MMPs是一組含有Zn2+的依賴Ca2+的能夠降解或修飾細胞外基質的蛋白酶，正常情況下以酶原形式存在，被控制在較低水平，當腦組織缺血及再灌注時，其活性明顯增加。MMPs中以MMP-2和MMP-9的活性最強，成為近年來研究的熱點。在中樞神經中血管內皮細胞、神經元細胞、膠質細胞和周細胞均能產出MMP-2和MMP-9酶原。MMP-2酶原能被MT-MMP激活，MMP-9能被MMP-3以及局灶性缺血產生的自由基激活。MMPs的作用和活性可以被一些炎性因子進一步放大［28］。

MMP-2在缺血再灌注血腦屏障破壞的初始階段起著重要的作用。Yang等［29］通過原位酶譜法研究早期缺血的區域，發現MMP-2及MMP-9的活性均有增加，但是主要以MMP-2為主，進一步測定mRNA及MT1-MMP表明MMP-2在缺血初期的重要作用。缺血后再灌注3h導致的MMP-2及MMP-9上升使得claudin-5和occludin蛋白斷裂后再重新定位，且這一現象可以被MMPs抑制劑所逆轉。

MMP-9在缺血再灌注血腦屏障破壞的第二階段起著重要的作用。與野生型小鼠相比，MMP-9基因敲除的小鼠在缺血再灌注后的血腦屏障破壞及腦水腫均明顯減少［30］。先前認為MMP-9通過水解腦血管基底部的相關蛋白而導致血腦屏障的破壞，引起血管源性腦水腫的發生。最近研究發現，MMP-9能直接作用于緊密連接相關蛋白使其降解，這些蛋白包括occludin，ZO-1等。Occludin蛋白作為MMPS的作用底物，其中中含有MMP切割位點。對于MMP-9能否降解Claudin蛋白，目前仍有爭論。Alexander等發現VEGF能激活MMP-9并增加血管通透性，而VEGF阻滯劑能降低血管通透性并能減弱缺氧導致的MMP-9活性增加［31］。

3.4 炎性介質 腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素-1β （IL-1β）在炎癥開始階段引發了炎癥的反應。TNF-α、IL-1β和IL-6能增加毛細血管內皮細胞的細胞旁通透性，而這一現象能被環加氧酶抑制劑所逆轉［32］。TNF-α通過改變細胞骨架肌動蛋白的形態分布及減少ZO-1的表達量導致緊密連接蛋白的破壞。有學者對腸上皮緊密連接的研究發現，TNF-α增加細胞旁通透性的作用通過核因子kB（NF-kB）起作用，進一步通過抑制劑抑制NF-kB后發現，緊密連接的破壞有所改善，ZO-1的蛋白水平的減低和蛋白移位均不明顯［33］。

白細胞介素-1（IL-1）對血腦屏障的破壞與其導致Occludin和ZO-1蛋白的減少有關。對腸上皮緊密連接的研究，IL-1能夠降低Occludin蛋白的表達水平以及減少Occludin-mRNA的水平。另一項研究表明，IL-1的拮抗劑能顯著減少24h缺血再灌注小鼠的腦梗死面肌及降低血腦屏障的通透性［34］。IL-6能夠導致ZO-1的移位和肌動蛋白的重組，從而導致血腦屏障的破壞。IL-6基因敲除的小鼠腸上皮間隙通透性的增加與緊密連接蛋白ZO-1的穩定性破壞有關［35］。

單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1/CCL-2）以及CCL-2受體（CCR-2）在缺血再灌注時顯著升高。Dimitrijevic等［36］通過對血管內皮細胞和星形細胞共同培養創建的缺血再灌注的體外模型發現，血腦屏障通透性的增加伴隨著CCL-2和CCR-2（CCL-2的受體）的增加以及緊密連接Claudin-5、Occludin和ZO-1的減少和形態的改變，進一步應用CCL-2抑制劑或CCR-2阻斷劑均能夠提高血腦屏障的通透性，緩解緊密連接蛋白的破壞。

1 Abbott NJ， Patabendige AAK， Dolman DEM， et al. Structure and function of the blood-brain barrier .Neurobiol Dis， 2010， 37（1）：13～25.

2 Begley DJ， Brightman MW. Structural and functional aspects of the blood-brain barrier. Prog Drug Res，2003， 61：39-78.

3 Furuse M， Fujita K， Hiiragi T， et al. Claudin-1 and -2： novel integralmembrane proteins localizing at tight junctions with no sequence sililarity to occludin. Cell Biol，1998，141（7）：1539～1550.

4 Praveen B， Alex B， Maiken N. The blood-brain barrier： an overview structure， regulation， and clinical implications . Neurobiology of disease ，2004，16（1）：1～13.

5 Furuse M， Hirase T， Itoh M， et al. Occludin： a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. Cell Biol，1993，123（6）：1777～1788.

6 Ando-Akatsuka Y， Saitou M， Hirase T， et al. Interspecies diversity of the occludin sequence： cDNA cloning of human， mouse， dog， and ratkangaroo homologues. Cell Biol， 1996，133（1）：43～47.

7 Hirase T， Staddon JM， Saitou M， et al. Occludin as a possible determinant of tight junction permeability in endothelial cells. Cell Sci，1997，110（3）：1603～1613.

8 Martin PI， Lostaglio S， Schneemann M， et al. Junctional adhesion molecule，a novel member of the immunoglobulin superfamily that distributes at intercellular junctions and modulates monocyte transmigration. Cell Biol，1998，142（1）：117～127.

9 Aurrand LM， Johnson LC， Wong C， et al. Heterogeneity of endothelial junctions is reflected by differential expression and specific subcellular localization of the three JAM family members. Blood，2001，98（13）：3699～3707.

10 Mayer BJ. SH3 domains： complexity in moderation. Cell Sci，2001，114（7）：1253～1263.

11 Cordenonsi M， Atri FD， Hammar E， et al. Cingulin contains globular and coiled-coil domains and interacts with ZO-1，ZO-2，ZO-3，and myosin. Cell Biol， 1999，147（7）：1569～1582.

12 Lai CH， Kou KH， Leo JM， et al. Critial role of actin in modulating BBBpermeability. Brain Res Rev， 2005，50（1）：7～13.

13 王靜娥，田國萍，周進， 等，大鼠腦缺血時緊密連接相關蛋白Occludin 和Claudin-5的表達變化. 解剖科學進展， 2010，16（2）：149～152.

14 孫偉，楊鯤鵬，盛利，等，大鼠局灶性腦缺血再灌注血腦屏障超微結構及緊密連接蛋白Occludin變化的研究.中風與神經疾病雜志，2007，24（4）：425～427.

15 Kago T， Takagi N， Date I， et al. Cerebral ischemia enhances tyrosine phosphorylation of occludin in brain capillaries. Biochem Biophys Res Commun， 2006，339（4）：1197～1203.

16 吳麗文，尹飛，彭鏡，等，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和actin參與缺氧缺血誘導的血腦屏障通透性增加.中國當代兒科雜志，2008，10（4）：513～516.

17 Fisher S， Wiesnet M， Marti HH， et al. Simultaneous activation of several second messengers in hypoxia-induced hyperpermeability of brain derived endothelial cells. Cell Physiol， 2004，198（3）：359～369.

18 Kali H， Roger G， William S， et al. TRPC-mediated actin-myosin contraction is critical for BBB disruption following hypoxic stress. Cell Phy，2010，298（6）：1583～1593.

19 Wachtel M， Frei K， Ehler E， et al. Extracellular signal-regulated protein kinase activation during reoxygenation is required to restore ischemiainduced endothelial barrier failure. Biochem，2002，367：873～879.

20 Angelow S， Zeni P， Hohn B， et al. Phorbol ester induced short-and long-term permeabilization of blood-CSF barrier in vitro. Brain Res，2005，1063（2）：168～179.

21 Atkinson SJ， Melanie A， Hosford， et al. Mechanism of actin polymerization in cellular ATP depletion. BiolChem， 2004，279：5194～5199.

22 Granger DN， Kubes P. The microcirculation and inflammation： modulation of leukocyte-endothelial cell adhesion. Leukoc Boil，1994，55（5）：662～675.

23 Seibert A， Thompson FWJ， Taylor A， et al. Reversal of increased microvascular permeability associated with ischemia-reperfusion： role of cAMP. Appl Physiol，1992，72（1）：389～395.

24 Wong D， Katerina DZ， Vincent SR， et al. Cytokines， nitric oxide，and cGMP modulate the permeability of an in vitro model of the human blood-brain barrier. Exp Neurol， 2004，190（2）：446～455.

25 Yuji T， Norio T， Kazutoshi M， et al. Inhibition of Src activity decreases tyrosine phosphorylation of occludin in brain capillaries and attenuates increase in permeability of the blood-brain barrier after transient focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism，2009，29：1099～1108.

26 Tiruppathi C， Richard DM， Biman C， er al. Role of Ca2+ signaling in the regulation of endothelial permeability. Vascul Pharmacol， 2002，39（4-5）：173～185.

27 Hempel A， Lindschau C， Maasch C， et al. Calcium antagonists ameliorate ischemia-induced endothelial cell permeability by inhibiting protein kinase C. Circulation， 1999，99：2523～2529.

28 Harkness KA， Adamson P， Sussman JD， et al. Dexamethasone regulation of matrix metalloproteinase expreesion in CNS vascular endothelium. Brain， 2000，123（4）：698～709.

29 Yang Y， Eduardo YE， Jeffrey FT， et al. Matrix metalloproteinasemediatied disruption of tight junction proteins in cerebral vessels is reversed by synthetic matrix metalloproteinase inhibitor in focal ischemia in rat. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism， 2007，27：697～709.

30 Asahi M， Wang XY， Mori T， et al. Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of blood-brain barrier and while matter components after cerebral ischemia. Neurosci， 2001， 21（19）：7724～7732.

31 Alexander TB， Heinrich FB， Tamer R， et al. Matrix metalloproteinase-9 mediates hypoxia-induced vascular leakage in the brain via tight junction rearrangement. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism， 2010，30：837～848.

32 Candelario JE， Taheri S， Yang Y， et al. Cyclooxygenase inhibition limits blood-brain barrier disruption following intracerebral injection of tumor necrosis factor-α in the rat. Cereb Blood Flow Metab，2007，323（2）： 488～498.

33 Ma TY， Iwamoto GK， Hoa NT， et al. TNF-alpha-induced increase in intestinal epithelial tight junction permeability requires NF-kappa B activation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2004，286（3）：367～376.

34 Yang GY， Liu XH， Kadoya C， et al. Attenuation of ischemic inflammatory response in mouse brain using an adenoviral vector to induce overexpression of interleukin-1 receptor antagonist. Cereb. Blood Flow Metab， 1998，18：840～847.

35 Yang RK， Han XN， Takashi U， et al. IL-6 is essential for development of gut barrier dysfunction after hemorrhagic shock and resuscitation in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol，2003，285（3）：621～629.

36 Dimitrijevic OB， Stamatovic SM， Keep RF， et al. Effects of the chemokine CCL2 on blood-brain barrier permeability during ischemia-reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism， 2006，26：797～810.

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