線粒體形態學變化與急性缺血性卒中相關性的研究進展

李俞辰，王永朋，戴家興，吳培，史懷璋

缺血性卒中病理生理過程中主要涉及的因素有氧化應激、鈣超載、自噬和細胞凋亡等[1-3]。而神經元細胞內線粒體的形態學變化在以上致病因素中均有著不容忽視的作用[3-4]。

線粒體是哺乳動物細胞內重要的細胞器，主要功能有產生能量，調節Ca2+穩態，參與氧化磷酸化、神經突觸的形成及細胞凋亡等[5-6]。作為高度動態的細胞器，在不同的細胞活動和外界刺激下，線粒體數量、分布及形態會發生頻繁的變化，目前研究證實線粒體的這些動態變化主要是通過自身分裂、融合的形態學變化而實現的[7]。近年來，線粒體形態學在神經系統疾病中的相關研究逐漸增多。為此，本文就線粒體的分裂、融合，特別是其在缺血性卒中病理生理過程中的功能做一綜述。

1 線粒體的分裂與融合

1898年，德國科學家卡爾·本達發現細胞內的一些結構時而呈線狀時而呈顆粒狀，并將其命名為線粒體。之后的研究逐步揭示，線粒體是一個動態、巨大的管網狀結構，并處于不斷的重組中，具有高度的可塑性[8]。一般情況下，由于線粒體分裂與融合活動是同時進行且速度基本相同從而能保持相對穩定的形態和功能[7]。而病理條件下，這一動態平衡將被破壞，當分裂、融合中一方活性被抑制時，另一方活性將顯著增強，致使線粒體形態學平衡被破壞，并進一步導致線粒體的功能障礙，如能量生成障礙、活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產生增加和細胞凋亡異常增強等[9-10]。

分裂與融合各自的功能具有既互補又獨立的特性，并受到多種蛋白質的精細調節[6]，其中分裂可以增加線粒體的數量和分布，對于調控細胞不同部位的鈣離子水平、膜電位的維持及神經元細胞器的運輸等有重要意義[11]，調節分裂活動的蛋白質主要有：Drp1和Fis1等[12]。而融合則可促進各類細胞內信號的傳遞、膜電位的傳導及線粒體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的互補修復等[13-14]，調節融合活動的蛋白質主要有：Mfn1、Mfn2、Opa1及Ugo1等[15]。除以上提到的蛋白外，Bcl-2蛋白家族，如Bax、Bcl-2及Bif-1也參與線粒體分裂、融合的調節。Wang[16]和Grohm[4]等已證實，Bcl-2蛋白家族主要通過與Drp1等分裂、融合蛋白的協同作用，對線粒體的形態產生影響。

2 線粒體分裂、融合與急性缺血性卒中發病機制的相關性

人類神經元能量需求高，并承擔著興奮的產生與傳導，遞質的釋放與結合，以及穩定機體內環境等多種功能，而線粒體作為與細胞功能息息相關的細胞器，對神經元尤為重要，特別在各類神經系統疾病中，線粒體將參與整個損傷、應激及修復過程中[17]。

急性缺血性卒中損傷不僅能同時上調神經元細胞的凋亡和自噬，還可誘導氧化應激反應產生大量的ROS，而且通過對Ca2+分布的影響造成線粒體內鈣超載[18]，但有研究認為線粒體的分裂增加可能是上述損傷機制的上游事件[19]。經Lackner等[20]證實，促進線粒體融合或抑制線粒體分裂可以減輕腦缺血再灌注后神經元細胞的損傷，在大鼠大腦中動脈栓塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的相關實驗中，抑制線粒體分裂，可使腦組織的梗死面積明顯減小[17，21]。綜上可知，線粒體形態學異常在缺血性卒中的病理生理過程中具有關鍵性作用。

2.1 線粒體分裂、融合與氧化應激 線粒體是細胞內氧化還原反應和氧消耗的主要場所，并且是ROS的主要來源及作用位點[22]。氧化應激反應是指機體和細胞內ROS產生和消除失衡。過量的ROS將造成DNA、蛋白質的合成障礙，脂質過氧化乃至細胞凋亡[23]。線粒體分裂、融合與氧化應激及其所致的細胞凋亡關系密切。正常機體中，線粒體內含有多種抗氧化酶類，其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），特別是錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD），能夠大量地消除ROS，對抗氧化應激損傷[12]。

體外的糖氧剝奪模型（oxygen-glucose deprivation，OGD）和體內的腦組織缺血再灌注實驗（ischemia/reperfusion，I/R）都是用來模擬人類缺血性卒中的病理生理過程，且有關二者的研究均證實，無論是氧化應激反應本身還是線粒體分裂活動增加，均可使ROS產生增多，SOD含量降低，進一步惡化氧化應激所造成的損傷甚至引起細胞凋亡[19，24]。Tian等[25]通過使用Drp1的選擇性抑制劑Mdivi1作用于體外的OGD和再灌注模型，可以顯著地降低線粒體內ROS水平，減輕氧化應激損傷，在ROS介導的線粒體凋亡途徑中起到保護作用。由此可見，急性卒中后，線粒體的分裂活動增強，與氧化應激損傷之間有密切的聯系，并且二者可協同作用，造成細胞凋亡及組織損傷。

2.2 線粒體分裂、融合與鈣超載 1981年有研究就已發現Ca2+可誘導線粒體出現片段化現象。隨后的研究證實，Ca2+可通過介導Drp1的磷酸化和去磷酸化作用來影響線粒體的分裂、融合平衡，其中細胞內的Ca2+可激活鈣調神經磷酸酶（calcineurin，CN），也稱蛋白磷酸酶2B（protein phosphatase 2B，PP2B），引起Drp1的磷酸化及向線粒體外膜的聚集，促進線粒體的分裂，間接影響細胞的存亡[26-27]。另外，某些促細胞凋亡刺激，如過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）和花生四烯酸等，可導致細胞內Ca2+自內質網（endoplasmic reticulum，ER）向線粒體釋放，引發線粒體內鈣超載和Caspase介導的細胞凋亡級聯程序[28]。Han等[29]對神經元的研究發現，Ca2+可以通過電壓依賴性鈣離子通道（voltage-dependent calcium channels，VDCC）進入細胞，然后激活Ca2+／鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Iα，誘導線粒體活動停止和分裂增加。

在PC12細胞的OGD模型中，Ca2+顯像和免疫熒光掃描結果顯示，通過使用Drp1選擇性抑制劑抑制線粒體分裂后，雖然細胞質中Ca2+水平無明顯變化，但可以顯著降低ER中Ca2+的釋放和線粒體中Ca2+的攝取，一定程度上防止了鈣超載損傷的出現[25]。但先前Szabadkai等[30]研究顯示Drp1促進線粒體分裂的同時，可影響線粒體內Ca2+的升高，并減輕鈣離子介導的細胞凋亡。因此Ca2+分布與線粒體形態之間的相互關系還有待進一步研究確認。

此外Ca2+信號還可以通過其他機制調節線粒體的分裂、融合，例如新近發現的Miro三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶類（主要是Miro1和Miro2），正常情況下，Miro1/2能促進線粒體的融合，但在高Ca2+濃度的情況下則會加快線粒體分裂[15]。

2.3 線粒體分裂、融合與細胞凋亡 缺血性卒中的多種致病機制最終都能引起細胞的凋亡，并且這種增強的凋亡變化與線粒體分裂、融合失衡密切相關[31-32]。體內外試驗均證實，急性腦缺血再灌注損傷中，線粒體分裂的增加可以促進細胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）的活化、釋放及細胞凋亡[33]。在神經元凋亡機制的研究中，Cyt-C的活化被認為是線粒體凋亡途徑和Caspase介導凋亡途徑的關鍵一步，Cyt-C是呼吸鏈的重要組成部分，胞質內Cyt-C水平的升高，會促進凋亡小體的形成[凋亡蛋白酶活化因子1，caspase-9酶原和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等組成]，進而導致線粒體呼吸活性的喪失和后續的級聯凋亡反應[34]。

調控Cyt-C釋放的因素很多，目前研究較多的是Bax蛋白和線粒體分裂、融合蛋白如Opa1、Drp1等。Bax蛋白除可促進Cyt-C釋放啟動凋亡反應外，在細胞受到損傷刺激時，還可與增加的Drp1蛋白協同作用于線粒體外膜，促進線粒體分裂，間接啟動凋亡[4]。Bax和Drp1蛋白還可使線粒體外膜的通透性增加，促進Cyt-C的釋放[24]。使用Opa1si RNA抑制Opa1表達可引起線粒體的片段化，并能觀察到Cyt-C釋放和細胞凋亡增加[35]，相反，通過Drp1抑制劑（Mdivi1）可以降低線粒體的片段化，減少細胞色素C的釋放、凋亡蛋白的活化及細胞凋亡[7，36]，其他分裂、融合蛋白的實驗結果同樣支持類似的結論。另外，線粒體分裂、融合失衡也與上述鈣超載，氧化應激相互促進，導致細胞凋亡。凋亡早期線粒體就已發生顯著的片段化，線粒體的分裂、融合蛋白參與細胞凋亡，調控凋亡的分子也能夠改變線粒體的形態[32]。

2.4 線粒體分裂融合與線粒體自噬 自噬在急性缺血性卒中的早期就已出現，其具體功能還存在爭議。一方面，自噬是細胞自體修復的重要過程，可以維持細胞內環境的穩態而使細胞避免受到進一步損傷[37]；另一方面，有的研究顯示，缺血缺氧損害后，自噬又可與凋亡信號產生交互協同作用，這一作用能加重海馬區神經元細胞損傷甚至導致細胞死亡[2]。

線粒體同樣存在自噬，即受損或過剩線粒體的選擇性清除過程，并受胞內各種因素的精密調節，是細胞清除損傷線粒體和維持自身穩態的一種重要調節機制[38]。線粒體分裂增加使線粒體數量增多，可以促進線粒體自噬，而自噬的激活又能增強線粒體的分裂，無論是過度的自噬還是線粒體分裂都可進一步加重細胞損傷。

Drp1磷酸化對線粒體的分裂和自噬有顯著促進作用，在有關小鼠線栓法大鼠大腦中動脈阻斷（middle cerebral artery occlusion，MCAO）實驗中，研究者可以檢測到Drp1磷酸化作用逐漸增強并在模型成功后14 d達到高峰[31]，也就代表著線粒體自噬在這期間也存在活性增強的過程。Cavallucci等[39]用哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑雷帕霉素作用于腦損傷的體外模型，可以得到線粒體自噬和分裂都增強的結果，并高度懷疑是自噬誘導線粒體分裂的增強，但卒中時線粒體形態變化與自噬的確切關系還有待證實。

急性缺血性卒中的缺血半暗帶，一直是醫生治療和改善患者預后的關鍵[18]。不斷積累的科研成果，使醫生對線粒體三維網狀結構的認識逐漸深入，線粒體分裂融合是細胞內獨特而復雜的過程，其在卒中病理生理過程中發揮著重要作用，眾多研究也通過使用Mdivi1等抑制劑來降低線粒體分裂水平，多數得到了如Cyt-C釋放減少、氧化應激損傷減輕和細胞凋亡緩解等良好效果。然而，其具體機制目前尚不能確切闡明，特別是其在出血性卒中領域的研究目前還很少。因此，未來需要醫學研究人員對線粒體分裂融合機制進行深入的研究，以期為今后各類疾病的治療提供新的靶點。

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