正交實驗法優選九味阿膠膏提取工藝研究

張潔　李成網

【摘要】目的優選九味阿膠膏的最佳提取工藝。方法以黃芪甲苷的含量為指標，ELSD-HPLC法測定指標成分含量，采用正交試驗設計考察加水倍數（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）三個因素的影響，確定九味阿膠膏的最佳提取工藝。結果煎煮因素按影響大小依次是煎煮次數（c）>加水倍數（A）>加醇倍數（B），最佳提取工藝條件為：A282C3。結論該制備工藝合理可行。

【關鍵詞】九味阿膠膏；正交試驗法；ELSD-HPLC；黃芪甲苷

【中圖分類號】R284.1 【文獻標識碼】B 【文章編號】2095-0616（2015）21-51-03

九味阿膠膏是安徽省中醫藥大學第二附屬醫院臨床使用多年的經驗膏方。該方由阿膠、黃芪、山楂、枸杞等九味中藥材加工精制而成。具有補肝腎，養精血，益氣健脾，養心安神，滋陰潤肺，溫經散寒之功效。臨床上主要用于治療氣血兩虛證。本文采用正交試驗法，以黃芪甲苷的含量為指標，對九味阿膠膏的提取工藝進行考察，篩選最佳的提取工藝。

1儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津），Sedex75 ELSD檢測器；梅特勒xp56型百萬分之一電子天平（瑞士）；梅特勒AG285電子分析天平（瑞士），黃芪甲苷（110781-200512）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），水（超純水），其他試劑均為分析純。黃芪等藥材購自合肥市中藥飲片廠義和堂藥店。

2方法

2.1正交工藝設計

選擇加水倍數（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）為考察因素，種因素取3個水平，因素水平設置，見表1。

2.2黃芪甲苷含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Shim Pack CLCODS柱（250×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（32：68）；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；ELSD漂移管溫度為83℃；氮氣壓力為2.0bar；理論板數按黃芪甲苷計算應不低于4000。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品（110781-200512）10.077mg，加甲醇溶解并定容至25mL，搖勻，即得。

2.2.3供試品溶液的處理 按九味阿膠膏處方，稱取黃芪17.7g，山楂15g及其他煎煮藥材共111g，按L₉（34）正交表（見表2），以水平因素表（見表1）規定的加水量、煎煮時間、煎煮次數煎煮，濾過，合并濾液，適當濃縮并定容至500mL量瓶，搖勻。精密量取正交試驗1～9號溶液各25mL，置分液漏斗中，加水飽和的正丁醇溶液25mL，振搖提取4次，分取正丁醇液，合并4次提取液，加2%氫氧化鈉溶液25mL，萃取2次，棄去氫氧化鈉溶液，正丁醇液再加水25mL，萃取2次，棄去水液，正丁醇液水浴揮干，殘渣以適量甲醇溶解，定量轉移置5mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm濾膜濾過，即得正交試驗的9份供試品溶液。

2.2.4對照品溶液線性關系考察分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液（0.4031mg/mL）2、4、8、12、16、20μL，依法測定峰面積，以黃芪甲苷進樣質量的常用對數值為橫坐標，黃芪甲苷峰面積的常用對數值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：IgA=1.38551gC+1.9782（r=0.9998，n=6）。結果表明：黃芪甲苷的質量在0.8062～8.062μg之間質量的常用對數值與峰面積的常用對數值呈良好的線性關系。

2.2.5精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液（0.4031mg/mL）20μL，連續進樣6次，依法測定峰面積積分值，計算，RSD=0.65%，說明儀器的精密度良好。

2.2.6供試品溶液的測定依照上述色譜條件，精密吸取正交試驗1～9號供試品溶液各20μL，依法測定。色譜圖見圖1～2。

3結果

3.1正交試驗

根據上述色譜條件，依次測定9份供試品溶液中黃芪甲苷的峰面積，將峰面積積分值的常用對數代入標準曲線，計算黃芪甲苷的含量，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

由方差分析結果可知，各因素顯著性差異依次為C>A>B，即煎煮次數>加水倍數>煎煮時間。方差分析顯示因素A和因素C的影響具有顯著性差異，其中A3>A2>A1，C3>C2>C1，因素B的影響無顯著性差異。因此，最終確定的最佳提取工藝為A382C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次1.5h。

3.2驗證試驗

依照處方，稱取黃芪17.7g，山楂15g及其他煎煮藥材共111g，按上述優選的工藝條件煎煮，平行試驗3次，結果黃芪甲苷平均含量為16.0212mg，RSD=1.39%。表明工藝條件穩定可行。

4討論

九味阿膠膏由九味中藥材組成，阿膠為方中君藥，但因阿膠是烊化后與清膏合并，不參與煎煮，故本文未選擇君藥的有效成作為考察指標。而黃芪為方中成藥，其主要有效成分有多糖類、黃酮類、皂苷類和氨基酸等。2010版中國藥典收載了黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定，但由于毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量較低，僅為黃芪甲苷含量的一半，且黃酮類成分容易被干擾，故本研究未采用毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為含量測定指標。ELSD-HPLC法測定中藥復方中黃芪甲苷含量的論文報道較多，在參考文獻的基礎上，本研究選擇黃芪甲苷作為含量測定的查考指標。在正交試驗之前，還考察了藥材吸水率實驗，平均吸水率為1.1倍，故第一次煎煮的加水量多加1.1倍的水。

目前，大多數中醫院使用的院內制劑工藝都比較簡單，多為生藥粉制備的丸劑或簡單的水煎劑，本研究方法和結果可以給醫院的制劑工藝優化提供參考和依據，也可以給含黃芪的復方制劑的含量測定提供參考。

根據黃芪甲苷含量的測定結果，煎煮時間對結果的影響未見顯著性差異，故從節約成本的角度考慮，工業化生產時可選擇只煎煮1h。最后的驗證試驗也很好的說明了，本文篩選的工藝條件是合理的，可重復的，適合工業化生產的。endprint