慢病毒介導穩定表達miR-183的人卵巢癌skov3細胞系

陳亞偉，樊冬梅，劉　剛，田曉予

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慢病毒介導穩定表達miR-183的人卵巢癌skov3細胞系

陳亞偉，樊冬梅，劉剛，田曉予

摘要：目的建立穩定表達miR-183的人卵巢癌skov3 細胞系。方法將Pre-miR-183、has-miR-183 inhibitor基因克隆到真核表達載體pEZX-MR03、pEZX-AM03中，構建成重組表達載體pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor，再將重組表達載體轉染至293T細胞中包裝慢病毒。用包裝好的慢病毒感染人卵巢癌skov3 細胞，經嘌呤霉素、潮霉素B篩選后獲得穩轉細胞系，最后用RT-PCR法檢測miR-183在轉錄水平的表達。結果分離培養出穩定高表達和低表達 mirR-183的單克隆細胞株。結論實驗成功建立了穩定表達miR-183的 skov3細胞系，為研究miR-183的生物學功能提供了有效的細胞模型。

關鍵詞：慢病毒；skov3細胞； miR-183；卵巢瘤

作者單位：河南科技大學第一附屬醫院，河南洛陽 471003

卵巢癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，由于其發病十分隱匿，大多數患者在確診時已經處于晚期，失去手術機會。雖然化療在卵巢癌的治療中占重要地位，但耐藥的產生也使卵巢癌化療難以取得理想效果[1-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類調節性小RNA，長約18～22個核苷酸，它本身不編碼蛋白，但對蛋白編碼基因有重要的調控作用。miRNAs與多種腫瘤密切相關，它可調控腫瘤相關基因的表達，參與腫瘤細胞的生長發育、凋亡、增殖、血管形成、侵襲遷移等一系列重要進程，在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用[5-7]。其中，miR-183在卵巢癌中存在異常表達，但它是促癌 miRNA 還是抑癌 miRNA，報道并非一致[8-9]。用miRNA芯片和實時RT-PCR技術檢測發現，與相對低侵襲力的skov3細胞相比較，miR-183在高侵襲力的SKOV3ip細胞中呈低表達[10]。而miR-22，miR-183和miR-31通過抑制Tiam1的蛋白表達，進而抑制細胞遷移、侵襲和生長，但不影響細胞凋亡。為研究miR-183在卵巢癌中的作用，作者采用慢病毒轉染試劑將Pre-miR-183、has-miR-183 inhibitor基因導入人卵巢癌skov3細胞中，并經嘌呤霉素、潮霉素B篩選，建立穩定表達mirR-183的細胞株，為今后研究miR-183的生物學功能提供有效的細胞模型。

1材料與方法

1.1材料人卵巢癌skov3細胞株購自中國科學院上海細胞庫，293T細胞由河南科技大學第一附屬醫院分子生物實驗室傳承。MiR-183的真核表達載體pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及陰性對照(negative control,NC)均由廣州復能基因有限公司構建。RPMI-1640培養基、DMEM高糖培養基(美國Gibco)，Opti-MEM?I (美國Invitrogen)、胎牛血清(以色列BI)，miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，Lenti-Pac HIV表達包裝試劑盒、miR-183 和 miR-U6 qPCR檢測引物、miRNA反轉錄及其qPCR試劑盒(廣州復能基因有限公司)，嘌呤霉素(美國 Life)，潮霉素B(美國Invitrogen)。

1.2方法

1.2.1確定嘌呤霉素、潮霉素B篩選濃度篩選前1 d，將skov3細胞以每孔5×104個接種到24孔板中，加入0.5 mL含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養，至細胞融合度達到60%～70%。嘌呤霉素(0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mg·L-1)、潮霉素B(100、110、120、130、140、150 mg·L-1)按不同濃度梯度分別加入到鋪好的24孔板中，每天換液，濃度不變，培養3 d使skov3細胞全部死亡的最小濃度即為篩選濃度。

1.2.2包裝慢病毒轉染前1 d，取對數生長期的293T細胞2×106個接種于10 cm細胞培養皿中，加入10 mL含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養，至細胞融合度達到50%～60%。分別將2.5 μg的pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及NC和5.0 μL的Lenti-Pac HIV加入到200 μL的Opti-MEM?I培養基中。 此外，另取200 μL的Opti-MEM?I培養基并加入15 μL的EndoFectin Lenti。最后，將后者倒入前者，混勻，室溫靜置20 min后，加到293T細胞中，培養48 h，收集細胞上清液， 經過離心(4 ℃，3 000 r·min-1，15 min)和過濾(0.45 μm)收集病毒液。

1.2.3細胞轉染轉染前12 h，將skov3細胞以每孔5×105個接種到6孔板中，加入2 mL含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養，至細胞融合度達到50%～60%；棄掉舊培養基，加入2 mL新鮮培養基，然后分別加入4種慢病毒液，24 h后換培養基并繼續培養。

1.2.4穩轉細胞株篩選觀察轉染后的skov3細胞熒光情況，并根據載體所攜帶抗性基因的不同，于轉染后72 h分別加入相對應的抗生素，嘌呤霉素(1 mg·L-1)，潮霉素B(120 mg·L-1)進行篩選(嘌呤霉素持續加入，潮霉素B加24 h撤24 h，反復3次)，根據細胞死亡情況及時更換培養基。常規傳代，待細胞狀態轉好后，藥物濃度加大1倍進一步篩選，待細胞篩純后，藥物濃度減半維持。

1.2.5RT-PCR檢測miR-183在skov3細胞中的表達 細胞轉染篩純后，用miRNA提取分離試劑盒提取miR-183，并檢測RNA質量及濃度。按照All-in-One TM miRNA qRT-PCR Detection Kit 說明書將miR-183反轉錄成cDNA，并擴增，均以U6為內參。PCR反應條件為：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 30 s延伸，共40個循環。

2結果

2.1嘌呤霉素、潮霉素B篩選濃度嘌呤霉素、潮霉素B篩選正常skov3細胞3 d后，嘌呤霉素濃度≥1 mg·L-1，潮霉素B濃度≥120 mg·L-1時，skov3細胞全部死亡。嘌呤霉素，潮霉素B的最佳篩選濃度分別為1 mg·L-1、120 mg·L-1。大約篩選10～14 d可獲得穩轉細胞株。

2.2包裝病毒、細胞轉染及篩選293T細胞24 h即出現熒光，48 h熒光最強。由圖1可見穩轉的skov3細胞株。其中，pEZX-MR03-183 mimics及NC攜帶eGFP標簽發出綠色熒光，pEZX-AM03-183 inhibitor及NC攜帶RFP標簽發出紅色熒光，并且細胞形態均無明顯變化。

2.3skov3細胞中miR-183的相對表達量RT-PCR檢測miR-183在各組穩轉skov3細胞株中的表達，包括4組分別為miR-183 mimics 及NC，miR-183 mimics及NC。采用經典的2-ΔΔCt相對定量計算方法來計算各組間的表達差異，與NC組相比較，inhibitor組下調 0.19倍，而mimics組上調13.54倍。

A、B為上調NC；C、D為miR-183 mimics；

3討論

異常表達的miRNA可能在卵巢癌的發生發展、侵襲轉移以及耐藥等過程中起重要作用。研究發現與卵巢癌細胞相關的miRNA包括：miR-7f、miR-10b、miR-21、miR-34、miR-145、miR-152、miR-181、miR-199a、miR-29a、miR-126、miR-101、miR-200c、miR-100、miR-182、miR-16、miR-15a、miR-20a、miR-205、miR-214等[12-20]在卵巢癌中表達異常。其中，miR-183在卵巢癌也是異常表達的[8-11]，但其究竟扮演癌基因還是抑癌基因的角色仍存在爭議。Dahiya等研究表明miR-183在卵巢癌組織中下調0.45倍。與正常卵巢組織相比hsa-miR-183-5p在卵巢癌組織中上調，提示miR-183可能參與卵巢癌的發展。與相對低侵襲力的skov3細胞相比較，miR-183在高侵襲力的SKOV3ip細胞中呈低表達[10]。通過建立穩定表達miR-183的卵巢癌細胞系，來進一步研究miR-183對卵巢癌細胞生物學行為的影響更是少見報道。

本實驗首先構建真核表達載體pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及相應NC，通過慢病毒介導的方法將其轉染至skov3細胞中，再用嘌呤霉素、潮霉素B對轉染后細胞進行篩選，最終獲得穩定表達miR-183的skov3細胞系。其中，細胞轉染及篩選過程至關重要，由于轉染前細胞的狀態好壞對最終的轉染效果影響很大，所以應保證加病毒之前細胞處于良好的生長狀態。而慢病毒液對細胞有毒性作用，剛轉染過的細胞狀態不好，篩選時間及藥物濃度不易掌握，可常規培養細胞至其狀態好轉后再篩選。并且，在篩選過程中要及時觀察細胞狀態，以免篩選過度損傷轉染成功的細胞導致實驗失敗。本研究通過RT-PCR檢測各組穩轉細胞株中miR-183的表達情況，成功建立miR-183慢病毒介導的skov3穩轉細胞系，為以后進一步研究miR-183與卵巢癌skov3細胞生物學特性(增殖、凋亡、侵襲、耐藥、裸鼠成瘤等)的相關性提供細胞學模型，為研究miR-183與卵巢癌的關系奠定基礎。

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Establishment of Human Ovarian Cancer Skov3 Cell Line Stably

Expressing miR-183 by Lentiviral System

CHEN Ya-wei,FAN Dong-mei,LIU Gang,et al

(First Affiliated Hospital，Henan University of Science & Technology，Luoyang 471003，China)

Abstract:ObjectiveTo establish human ovarian cancer skov3 cell line stably expressing miR-183. MethodsThe gene of Pre-miR-183,has-miR-183 inhibitor were cloned into eukaryotic expression vector,respectively,yielding pEZX-MR03-183 mimics, pEZX-AM03-183 inhibitor. The pEZX-MR03-183 mimics,pEZX-AM03-183 inhibitor were transfected into 293T cells for acking lentivirus, and the lentivirus transfected in human ovarian cancer skov3 cells. Screening with puromycin and hygromycin B, there got the stable transfection skov3 cell line, and through RT-PCR to verify the expression of miR-183 at transcription level. ResultsThe monoclonal skov3 cell line with stable high and low expression of miR-183 were successfully isolated and cultured.ConclusionThe study successfully establish the stably transfected skov3 cell lines of miR-183 that could be used to be an effective cell model to research the biological functions of miR-183.

Key words:lentivirus；skov3 cell；miR-183；ovarian cancer

通信作者：田曉予，女，博士，教授，E-mai：tiaoxiaoy1210@163.com

作者簡介：陳亞偉(1988-)，女，河南開封人，從事婦科腫瘤的基礎與臨床研究工作。

收稿日期：2015-07-09

中圖分類號：R737.31

文獻標志碼：A

文章編號：1672-688X(2015)04-0248-04