bFGF在百草枯誘導大鼠肺纖維化過程中的表達

徐宏業，喬博亞，張　杰，鮑志宇，秦豪杰，莫耀南

?

bFGF在百草枯誘導大鼠肺纖維化過程中的表達

徐宏業1，喬博亞2，張杰1，鮑志宇1，秦豪杰1，莫耀南1

摘要：目的探討堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在百草枯誘導大鼠肺纖維化組織中的表達及其作用。方法健康清潔雄性SD大鼠45只，體質量(350±20) g，分為實驗組和對照組。實驗組大鼠腹腔注射10 mg·kg-1百草枯溶液，對照組大鼠注射等滲鹽水。實驗組大鼠分為1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d組，每組5只，按觀察時間分批處死，對照組大鼠飼養28 d后處死。觀察每組大鼠肺形態學變化，肺組織蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色，免疫組化SP法檢測bFGF在大鼠肺組織中的表達。 結果染毒后大鼠出現異常行為變化；肺組織3 d出現中性粒細胞浸潤，5 d時膠原纖維增生，14 d時肺泡周圍不規則膠原纖維明顯增多，28 d時肺明顯纖維化，膠原纖維廣泛分布。bFGF免疫組化染色示染毒大鼠支氣管黏膜上皮、肺泡壁上皮、炎性細胞以及肺泡腔內的巨噬細胞內bFGF呈陽性表達，且隨著時間變化，其表達逐漸增高，而至28 d時稍減弱。結論百草枯中毒后肺纖維化，隨著時間的推移程度不斷加深。bFGF在百草枯大鼠肺纖維化過程中表達上調，至28 d時稍減弱，其可能參與百草枯大鼠肺纖維化過程，其機制有待于進一步研究。

關鍵詞：百草枯；肺纖維化；大鼠；bFGF

百草枯(paraquat,PQ)，化學名稱為1-1-二甲基-4-4-聯吡啶陽離子鹽，分子式為C12H14N2’2Cl，分子量為257.2 Da。PQ是有機雜環類接觸性除草劑，因其除草效果良好而在我國農村被廣泛使用。但自PQ使用以來，世界各地出現大量的中毒病例，甚至在亞洲、加勒比海地區和太平洋島國，口服百草枯成為一種常見的自殺方式[1-3]。PQ有著極強的毒性，且沒有有效的治療方式，致死率很高。Hwang等報道PQ中毒的病死率為40%～50%，國內為85%～95%，肺是百草枯作用的主要靶器官，其機制是百草枯毒素在富氧的肺組織中氧化，中性粒細胞大量積聚，產生大量的氧自由基，造成肺泡的損傷。主要表現為早期肺泡上皮細胞受損，肺泡出血、水腫，炎性細胞浸潤，晚期則出現肺不可逆性纖維化。而且，百草枯中毒非急性死亡的病人大多在15～30 d發生肺纖維化。

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纖維細胞生長因子家族中的一員，它在人體中的分布非常廣泛，主要分布于腦、肝、心臟、腎、骨、甲狀腺、軟骨等組織，還分布于單核巨噬細胞、肝細胞、成肌細胞和星形細胞等。純化的bFGF是一條單鏈，含有146個氨基酸，其基因位于人類染色體的4q25處，基因長約38 kb[9-10]。bFGF具有強大的促進細胞分裂增殖的作用，能夠促進成纖維細胞的增生和膠原纖維的合成、可以激活內皮細胞合成細胞外基質等[11]?；赽FGF的功能作用，其在百草枯致肺纖維化過程中可能具有一定的意義。

本實驗通過建立百草枯誘導肺纖維化模型， HE及Masson染色觀察其組織病理學改變，應用免疫組織化學技術檢測bFGF在大鼠肺組織中的表達，探討百草枯致肺纖維化的病理過程及bFGF在其中的可能機制，為后續進一步的百草枯中毒機制研究奠定基礎。

1材料和方法

1.1實驗動物與材料健康清潔雄性SD大鼠45只，體質量(350±20) g ，由河南科技大學醫學動物實驗室提供。百草枯純品購于美國Fluka公司，Masson染色試劑盒購于北京Solarbio科技有限公司，兔抗大鼠bFGF多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，兔Streptavidin-HRP試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2模型建立健康清潔雄性SD大鼠 45只，分為1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d組和空白對照組，每組5只。實驗組大鼠腹腔一次性注射百草枯溶液，給藥劑量為10 mg·kg-1；對照組大鼠同樣方法腹腔注射等滲鹽水。觀察大鼠染毒后的行為學改變，每天2次。實驗組大鼠分別于第1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d分批處死，對照組大鼠飼養28 d后處死。所有大鼠脫頸處死后剖胸觀察肺外觀并取出肺，4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，切片(片厚4 μm)，蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色觀察肺組織病理學改變和肺纖維化情況。

1.3免疫組化染色石蠟切片常規脫蠟、水化，經抗原修復(0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液，微波熱修復)、3% H2O2孵育去除內源性過氧化物酶，滴加山羊血清封閉液。每片滴加bFGF多克隆抗體(1∶300稀釋)50 μL，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗3 min×3次。每片滴加生物素標記的二抗工作液50 μL，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3 min×3次。每片滴加HRP標記的鏈酶親和素50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次。DAB顯色3 min。蘇木素復染，中性樹膠封固。陰性對照用PBS替代一抗。

2結果

2.1大鼠行為學觀察正常對照組大鼠活潑好動，肥碩強壯。實驗組大鼠染毒6 h后即出現呼吸急促，鼻翼扇動明顯，少活動，呈匍匐狀態，腹式呼吸明顯而幅度大；且隨著染毒時間的延長，動物出現前爪抹鼻，毛發缺乏光澤且直立不倒伏，食欲差；部分大鼠動作遲緩，活動減少，出現皮膚發紺，神志差，走路左右搖晃不定、小心翼翼等癥狀。

2.2肺組織形態觀察正常對照組大鼠肺部呈鮮紅色，質地柔軟，切面無出血。實驗組大鼠在腹腔注射百草枯1～3 d，肺體積稍增大，肺邊緣變鈍圓，質地柔軟，呈紅褐色，散在點養廉瘀斑，輕觸后切面有泡沫狀液體滲出；腹腔注射百草枯5～14 d，肺組織有不同程度的萎縮，顏色暗紅，質地稍硬，輕觸后切面有較少的液體滲出；腹腔注射百草枯21～28 d，肺組織萎縮嚴重，部分肺組織表面凹凸不平，質地變硬，顏色蒼白，肺部分區域出現明顯的瘢痕組織。

2.3肺組織HE與Masson染色HE染色結果顯示，1 d組大鼠肺組織除肺間質小血管及肺泡壁毛細血管擴張充血外，其余與正常對照大鼠肺組織沒有明顯差異；Masson染色顯示肺間質除部分細支氣管周圍外未見有膠原纖維。3 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺泡隔增寬，肺間質小血管及肺泡壁毛細血管擴張充血，少量炎性細胞浸潤，部分肺泡腔內見大量淡紅染水腫液；Masson染色顯示肺泡隔內未見有明顯膠原纖維。5 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺泡隔增寬，炎性細胞增多，部分肺泡腔內出血；Masson染色顯示肺泡隔內有少量淡藍色膠原纖維。7 d組大鼠肺組織HE染色結果基本與5 d組相同，肺間質有大量炎性細胞浸潤，部分肺泡萎陷；Masson染色顯示肺泡隔中顯藍色的膠原纖維增多。

10 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺泡隔增粗明顯，部分肺泡腔萎陷，大量炎性細胞浸潤；Masson染色顯示肺泡隔膠原纖維增多。14 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺泡間隔進一步增寬，間質小血管淤血明顯，部分肺泡萎陷實變(見圖1)；Masson染色顯示肺泡隔內膠原纖維較前增多(見圖2)。

圖2　染毒14 d，肺間質膠原纖維增多(Masson，×100)

21 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺組織實變，肺泡形態已不易分辨；Masson染色顯示肺組織實變，大量膠原纖維沉積。28 d組大鼠肺組織HE染色顯示肺組織實變嚴重，難見到正常的肺泡腔(見圖3)；Masson染色顯示膠原纖維廣泛分布，呈不規則排列，肺纖維化明顯(見圖4)。

2.4bFGF在肺組織表達免疫組化染色結果顯示大鼠肺組織內bFGF多克隆抗體陽性表達產物呈棕黃色細顆粒狀，陰性對照均未見陽性表達。空白對照組在支氣管黏膜上皮、支氣管平滑肌和肺泡上皮有少量弱陽性表達，肺間質內未見陽性表達(見圖5)。實驗組大鼠在染毒初期bFGF的分布與表達強弱與正常對照組相比未見明顯差異。染毒5 d后 bFGF在支氣管黏膜上皮、肺泡壁上皮等處呈陽性表達，在部分炎性細胞及肺泡巨噬細胞質內呈弱陽性表達(見圖6)。隨著染毒時間的延長，陽性反應逐漸增強，染毒14 d后，bFGF在支氣管黏膜上皮、肺泡上皮及部分區域肺泡間質等處呈強陽性表達，在部分血管壁平滑肌及炎性細胞胞質內呈陽性表達(見圖7)。染毒28 d后，肺組織實變明顯，bFGF表達較前減弱，主要分布于支氣管黏膜上皮、部分血管壁平滑肌及炎性細胞胞質內(見圖8)。

圖3　染毒28 d，肺組織實變(HE，×100)

圖4　染毒28 d，肺實變，可見大量膠原纖維(Masson，×100)

圖5　bFGF在正常大鼠支氣管黏膜上皮、支氣管平滑肌和

圖6　染毒5 d，bFGF在支氣管黏膜上皮、肺泡壁上皮等處

圖7　染毒14 d，bFGF在支氣管黏膜上皮、肺泡上皮及部分

圖8　染毒28 d，bFGF表達較前稍減弱(SP，×400)

3討論

百草枯是一種在我國應用比較廣泛的除草劑，其中毒可引起多種臟器的損害，尤其以肺臟損害最為嚴重，急性期可導致肺充血、急性水腫，肺透明膜形成、增生變性等[12]，非急性死亡的病人大多在中毒后15～30 d發生肺纖維化，預后較差。本研究PQ中毒大鼠表現出動作遲緩，自主活動能力降低，活動減少，震顫、豎尾、豎毛。

HE和Masson染色顯示隨著染毒時間的延長，肺組織的損傷越來越重。在中毒早期(染毒1～3 d)，主要表現為急性肺淤血、急性肺水腫，部分肺泡腔內可見少量出血，中性粒細胞開始增多。在中期(染毒5～14 d)，隨著時間的延長，出現慢性炎癥，局部區域可見纖維組織增生。其機制可能是過量的氧自由基生成并誘導了炎性因子的損害作用，肺表面活性物質在不斷減少，而膠原纖維在不斷增生，導致肺萎縮、塌陷，彈性降低，肺的呼吸作用不斷喪失，最終會出現明顯纖維化。在終末期(染毒21～28 d)，肺組織大部分區域肺泡萎陷實變，大量膠原纖維沉積，最終形成纖維化。其結果和部分研究[5-7]基本一致，但從前期預實驗結果來看，使用純品百草枯染毒大鼠時使用劑量更易控制，實驗動物死亡率也明顯降低，故使用百草枯純品來制作肺纖維化模型更適宜于進一步實驗研究。

bFGF是一種能廣泛地促進來源于中胚層及神經外胚層細胞增殖的生物活性物質，其生理功能相當廣泛。其生物活性不僅能夠促進神經組織、軟組織等的損傷修復，促進新生血管形成，神經營養及肢體再生等等，它與器官纖維化的關系近年來亦引起關注。已有研究表明，肝纖維化[13]、腎纖維化[14]、系統性硬化癥[15]等均與bFGF有關，且對纖維化有促進作用。bFGF對成纖維細胞有著強烈的促增殖效應。本組中bFGF在大鼠染毒5 d后表達開始升高，并且隨著染毒時間的延長，陽性表達逐漸增強，至染毒28 d后，肺組織實變明顯，bFGF表達較前有所減弱。這與成纖維細胞增殖、膠原纖維沉積的過程基本一致，說明bFGF參與了大鼠肺纖維化的發生、發展過程。也即在損傷、炎癥的刺激作用下，支氣管黏膜上皮、肺泡壁上皮、炎性細胞以及肺泡腔內的巨噬細胞內bFGF表達水平上調，促進肺組織內成纖維細胞增殖并分泌膠原纖維，最終促使肺纖維化形成，其具體機制有待于進一步研究。

綜上所述，本實驗成功建立了百草枯致大鼠肺纖維化模型，并且隨著時間的推移，百草枯誘導的大鼠肺纖維化程度不斷加深。而且，bFGF在百草枯大鼠肺纖維化過程中表達上調，至28 d時稍減弱，提示bFGF可能參與百草枯大鼠肺纖維化過程，其機制有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]Dinis-Oliveira RJ,Duarte JA,Sánchez-Navarro A,et al. Paraquat poisonings: mechanisms of lung toxicity, clinical features, and treatment.Crit Rev Toxicol,2008,38(1):13-71.

[2]Meliconi R,Andreone P,Fasano L,et al.Incidence of hepatitis C virus infection in Italian patients with idiopathic pulmonary fibrosis.Thorax,1996,51(3):315-317.

[3]Hwang KY,Lee EY,Hong SYS.Paraquat intoxication in Korea .Arch Environ Herlth,2002,57(2):162-166.

[4]李紅，姬歡歡，王靜，等.百草枯中毒的臨床分析.臨床合理用藥，2013，6(7C)：105.

[5]謝仰民，陳韓秋.大鼠急性呼吸窘迫綜合征動物模型的建立.中國實驗動物學報,2002,10(4):244-245.

[6]王偉,宋祖軍.百草枯中毒致大鼠肺纖維化的實驗研究.中國急救醫學,2010,30(9):818-821.

[7]張紓難,韓春生.一種新的肺纖維化造模方法.中日友好醫院學報,1997,11(4):283-285.

[8]Plotnikov AN,Hubbard SR,Schlessinger J,et al.Crystal structures of two FGF-FGFR complexes reveal the determinants of ligand-receptor specificity .Cell,2000,101(4):413-424.

[9]Okada-Ban M,Thiery JP,Jouanneau J,et al.Fibroblast growth factor-2.Int J Biochem Cell Biol,2000,32(3):263-267.

[10]許會彬,張代民,曹英林.堿性成纖維細胞生長因子及受體與腫瘤的關系.臨床軍醫雜志,2005,33(1):98-100.

[11] Inoue Y,King TE Jr,Barker E,et al.Basic fibroblast growth factor and its receptors in idiopathic pulmonary fibrosis and lymphangioleiomyomatosis .Am J Respir Crit Care Med,2002,166(5):765-773.

[12]王英,年澤武,彭瑞云,等.血必凈注射液聯合地塞米松防治大鼠百草枯中毒慢性肺損傷的作用研究.中國中西醫結合急救雜志,2008,15(5):282-285.

[13]嚴家春,陳文筆,馬勇,等.慢性乙型肝炎肝組織中堿性成纖維細胞生長因子及其mRNA的表達.中華傳染病學雜志,2004,22(5):314-317.

[14] Acikgoz Y,Can B,Bek K,et al.The effect of simvastatin and erythropoietin on renal fibrosis in rats with unilateral ureteral obstruction.Ren Fail, 2014, 36(2):252-257.

[15] Lawrence A,Khanna D,Misra R,et al.Increased expression of basic fibroblast growth factor in skin of patients with systemic sclerosis.Dermatol Online J,2006,12(1):2.

Expression of bFGF in Process of Pulmonary Fibrosis

Induced by Paraquat in Rats

XU Hong-ye,QIAO Bo-ya,ZHANG Jie,et al

(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the model of pulmonary fibrosis by paraquat(PQ) in rats and investigate the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in the pulmonary fibrosis induced by PQ.Methods45 healthy male SD rats were divided into 1 d,3 d,5 d,7 d,10 d,14 d,21 d,28 d, and blank control group with 5 rats in each group. Rats in the experimental group were intraperitoneally injected with 10 mg·kg-1PQ solution, and the control group was injected isotonic saline solution. Rats in the experimental group were sacrificed at observation time, and the control group was fed 28 d. The pulmonary morphology changes, hematoxylin eosin staining (HE) and Masson staining of lung tissues were observed, and the immunohistochemistry method was used to detect the expression of bFGF protein in lung tissues of rats.ResultsAfter exposure of PQ the rat appears abnormal behavior in experimental group. The neutrophil infiltration were observed in rats after exposure of PQ 3 d, and proliferation of fibroblasts after 5 d, and the irregular collagen fibers were obviously increased surrounding the alveolar after 14 d. Pulmonary fibrosis was formed obviously after 28 d. In the experimental group,the positive expression of bFGF was found in the cytoplasm of inflammatory cell, bronchial mucosal epithelium and alveolar wall. Furthermore, the positive expression of bFGF was increased with exposure time until to 28 d, and then that was slightly decreased.ConclusionThe typical pulmonary fibrosis was induced by PQ poisoning, and the degree of pulmonary fibrosis

河南科技大學大學生研究訓練計劃項目(2014240)

作者單位：1.河南科技大學法醫學院，河南洛陽 471003

2.商丘市公安局梁園分局，河南商丘 476000

was continuously aggravated with exposure time. The expression of bFGF was increased with exposure time of PQ until to 28 d, and then that was decreased. Its mechanism need to be further studied.

Key words:paraquat；pulmonary fibrosis；rat；bFGF

通信作者：莫耀南，男，教授，E-mail：forensic@haust.edu.cn

作者簡介：徐宏業(1990-)，女，河南南陽人，從事法醫病理學研究工作。

收稿日期：2015-09-01

基金項目：河南省教育廳基礎研究項目(14B310001)

中圖分類號：R595.4,R563.9

文獻標志碼：A

文章編號：1672-688X(2015)04-0244-05