昆明地區碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌耐藥性分析及基因型檢測

胡　瑩，邰文琳，馬　潤，王　卓，番壽蕊，王玉明

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昆明地區碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌耐藥性分析及基因型檢測

胡瑩1，邰文琳2，馬潤1，王卓1，番壽蕊1，王玉明1

摘要：目的研究昆明地區臨床分離碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(CRE)耐藥性及基因型。方法收集2009年1月至2012年12月昆明地區三甲醫院分離的77株CRE；采用改良Hodge試驗表型檢測碳青霉烯酶、EDTA雙紙片協同試驗篩選金屬酶； PCR檢測blaNDM-1、blaKPC、blaIMP、blaVIM基因，對PCR產物純化、DNA測序。結果77株CRE以肺炎克雷伯菌為主，占75.32%(57/77)；本組CRE均為多重耐藥株；55株CRE改良Hodge試驗陽性，雙紙片協同試驗陽性15株；PCR擴增KPC基因陽性45株，NDM基因陽性9株，IMP基因陽性5株，18株未擴增出特異性條帶；IMP株為IMP-4亞型，KPC株為KPC-2亞型。結論KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶為昆明地區腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的主要型別，在臨床開展對CRE細菌產碳青霉烯酶型別的監測十分重要。在18株CRE中并未檢出目的基因，其耐藥機制有待于進一步的研究。

關鍵詞：腸桿菌科細菌；碳青霉烯酶；耐藥性；基因型

作者單位：1.昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，云南昆明 650101

2.云南省分子診斷中心，云南昆明 650101

腸桿菌科細菌是引起院內感染和社區獲得性感染的最常見的臨床致病菌之一，而對碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE)的出現，使得對于此類細菌引起的感染的臨床治療陷入無藥可用的境地。本文旨在對昆明地區腸桿菌科細菌中碳青霉烯類耐藥菌株檢測其耐藥性及基因型，為本地區泛耐藥(pandrug-resistant bacteria,PDR)腸桿菌科細菌的分子流行病學研究和醫院感染控制提供基礎資料。

1材料與方法

1.1菌株來源從2008年1月至2012年12月共收集102株碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌，主要來自昆明地區3家三甲醫院，包括昆明醫科大學第二附屬醫院93株、云南省人民醫院3株、昆明市延安醫院6株、所有細菌采用Vitek2細菌全自動鑒定儀鑒定。

1.2主要試劑與儀器藥敏紙片：12種抗菌藥物藥敏紙片均購自法國梅里埃公司，包括亞胺培南(imipenem，IPM)、美洛培南(meropenem，MEM)、厄他培南(ertapenem，ETP)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，TZP)、頭孢他啶(ceftazi-dime，CAZ)、頭孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，CPS)、頭孢吡肟(cefepime，FEP)、頭孢噻肟(cefoxitin，CTX)、環丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、阿米卡星(amikacin，AMK)、氨曲南(aztreonam，ATM)、復方磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole and trimethoprim，SXT)、四環素(tigecycline，TGC)；左氧氟沙星 (levofloxacin，LVF)藥敏紙片購于Oxoid公司。Vitek-2 compact細菌全自動鑒定儀為法國生物梅里埃公司產品；PCR擴增儀由PE公司生產。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗嚴格按照CLSI2008-2013年版推薦的K-B測定抗菌藥物的17種抗菌藥物的測定。

1.3.2耐藥表型檢測改良Hodge試驗依據CLSI(2009年)試驗方法及判定標準，EDTA協同試驗參考Lee等 試驗方法及判定標準。

1.3.3耐藥基因檢測DNA的提取：煮沸法提取菌株總DNA。PCR擴增目的基因：根據GenBank數據庫收錄的序列，引物設計參考文獻[2-3](見表1)，擴增碳青霉烯酶基因片段，包括KPC酶，金屬酶IMP、NDM-I、VIM型碳青霉烯酶，引物序列由上海生工生物工程公司合成，具體見表1。

表1　引物序列和產物大小

1.3.4DNA測序分析PCR反應產物委托杭州博尚生物技術有限公司純化、雙向測通并拼接，將得到的拼接序列與GenBank中Blast進行同源性分析，確定其基因型別。

2結果

2.1菌株分布檢出的77 株碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌中，肺炎克雷伯菌57株(75.32%)，弗勞地枸櫞酸桿菌8株(10.39%)，大腸埃希菌7株(9.09%)，產酸克雷伯菌2株(2.60%)，陰溝腸桿菌2株(2.60%)，產氣腸桿菌1株(1.30%)。

2.2藥敏試驗本組受試的77株CRE均為多重耐藥株，其中對頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南以及厄他培南的耐藥率為100%；對兩種酶抑制劑復方制劑(頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他巴唑坦)的耐藥率均為95%左右；對阿米卡星和環丙沙星的耐藥率分別為85.3%和97.1%。對四環素和復方磺胺甲惡唑耐藥率較低，分別為25.6%和27.9%。

2.3碳青霉烯酶表型篩選和雙紙片協同試驗77株CRE中55株改良Hodge試驗陽性，其中包括53株肺炎克雷伯菌，1 株陰溝腸桿菌，1株產酸克雷伯菌。雙紙片協同試驗陽性15株。

2.4碳青霉烯酶基因的PCR與測序77株腸桿菌科細菌中KPC基因陽性45株，見圖1。NDM基因陽性9株，見圖2。IMP基因陽性5株，見圖3。18株未擴增出特異性條帶。IMP型為IMP-4亞型，KPC株為KPC-2亞型。

圖1　部分KPC基因PCR產物電泳圖

圖2　部分NDM基因PCR產物電泳圖

圖3　部分IPM基因PCR產物電泳圖

3討論

近年來由于碳青霉烯類抗菌藥物臨床用量的不斷增長，革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率亦逐年上升。我國首次報道了產KPC酶肺炎克雷伯菌[6-8]，隨后在多個地區報道了產KPC酶腸桿菌科細菌的暴發流行[7-8]。本研究藥敏結果顯示，昆明地區CRE菌株除了對復方磺胺甲惡唑、四環素、阿米卡星等藥物有較高的敏感率之外，對其余臨床常用抗生素均表現為耐藥。近年來國內外對泛耐藥的耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌也常有報道，提示在此類泛耐藥菌株的臨床治療過程中，將以往的經驗性用藥變為依據藥敏試驗結果的目的性用藥，以保證較好的抗菌療效。

在醫院的高危患者中出現耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌并快速的國際傳播中[10]，抗菌藥物耐藥基因的水平播散是重要原因。本實驗對常見產酶基因型進行PCR檢測，結果顯示部分CRE攜帶blaKPC、blaNDM、blaIM基因。發現KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶為昆明地區腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的主要型別。18株未擴增出任何目的條帶的耐藥菌株，可能為膜孔蛋白表達下調，為本實驗未探討的其他耐藥機制引起。

碳青霉烯酶類抗生素目前是治療腸桿菌科細菌感染最有效的藥物，本次檢測昆明地區出現了KPC-2和NDM-1菌株，應引起臨床醫師的高度重視，臨床微生物實驗室應特別重視金屬酶及其他碳青霉烯酶的檢測，對控制耐藥菌株傳播和指導臨床合理用藥具有重要意義。

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·基礎醫學·

Drug Resistance and Genotype Analysis of Carbapenem-resistant

Enterobacteriaceae

HU Ying,TAI Wen-lin,MA Run,et al

(Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the drug resistance and genotype of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) in Kunming.Methods77 CRE isolates were collected from January 2009 to December 2012.Their carbapenemase phenotypes were detected by modified Hodge test and screened metallo-B-lactamase positive strains by EDTA disc synergy test. The blaNDM-1,blaKPC,blaIMP and blaVIM genes of carbapenemase were detected by PCR, then the obtained PCR products were performed DNA sequencing.Results75.32 percentage of CRE isolates were identified to be Klebsiella pneumoniae, and most of CRE are multi-drug resistant bacteria. The positive results of CRE isolates in the modified Hodge test and EDTA disc synergy test were 55 and 15 isolates respectively. The blaKPC gene was identified from 45 isolates by PCR, 9 blaNDM isolates and 4 blaIMP gene isolates were detected．IMP-4 and KPC-2 isolates was identified by DNA sequencing. The target gene of 18 CRE isolates were not detected.ConclusionThe KPC-2 and NDM-1 were the major genotypes of carbapenemase in Kunming hospital. It was important that drug resistance surveillance of CRE isolates. Target gene of 18 isolates were not detected, so their drug resistance mechanism should be further experimental study.

Key words:enterobacteriaceae；carbapenemase；drug resistance；genotype

通信作者：王玉明，男，主任醫師，E-mail：wangym992011@163.com

作者簡介：胡瑩(1977-)，女，江西南昌人，主治醫師，從事臨床微生物與分子生物檢驗工作。

收稿日期：2015-10-17

基金項目：云南省應用基礎研究面上項目(2013FB153)

中圖分類號：R378.2+1,R446.5

文獻標志碼：A

文章編號：1672-688X(2015)04-0241-03