不同基因型的鮑曼不動桿菌耐藥性及體外黏附能力差異的研究

塔　拉，　王俊瑞，　崔晶花，　杜小莉，　楊麗敏，　孫　鵬，　魏常梅，　張軍力

不同基因型的鮑曼不動桿菌耐藥性及體外黏附能力差異的研究

塔拉1，王俊瑞2，崔晶花3，杜小莉3，楊麗敏4，孫鵬4，魏常梅1，張軍力2

(1. 內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110；

2. 內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，內蒙古 呼和浩特 010050；

3. 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所， 北京 102206；

4. 內蒙古醫科大學病原生物學研究中心，內蒙古 呼和浩特 010059)

摘要：目的對不同基因型鮑曼不動桿菌的耐藥特征及體外黏附能力進行分析，為進一步闡明鮑曼不動桿菌耐藥性變遷與其黏附能力變化之間的相關性及指導鮑曼不動桿菌感染防控和治療提供試驗依據。方法采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對從內蒙古不同地區住院患者體內分離的具有不同耐藥性的50株鮑曼不動桿菌進行分子分型；采用纖維黏連蛋白黏附試驗對不同基因型分離株的體外黏附能力進行檢測。結果50株鮑曼不動桿菌共分為22個PFGE基因型，其中A和E型為優勢型，分別占22%(11/50)和24%(12/50)；L型對所有受試的抗菌藥物均耐藥，其余基因型耐藥表型差異明顯。從地區分布來看，A型主要分布在興安盟和赤峰市2個地區，而E型則分布在呼和浩特地區。體外黏附能力最強的菌株屬于G型和J型，其中J型對所有抗菌藥物均敏感；黏附能力最弱的菌株為D型，僅對碳青霉烯類藥物敏感。結論內蒙古地區鮑曼不動桿菌的基因型呈現多樣性，具有明顯的地域分布特征，特定基因型菌株具有相同或相近的耐藥特征。鮑曼不動桿菌耐藥性的增加與其體外黏附能力未見明顯相關性。

關鍵詞：鮑曼不動桿菌；耐藥性；脈沖場凝膠電泳；分子分型；體外黏附能力

Study on the drug resistance and in vitro adhesion ability difference ofAcinetobacterbaumanniiwith different genotypesTALa1，WANGJunrui2，CUIJinghua3，DUXiaoli3，YANGLimin4，SUNPeng4，WEIChangmei1，ZHANGJunli2

.(1.InnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongoliaHohhot010110,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongoliaHohhot010050,China； 3.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 4.PathogenicMicrobeResearchCenter,InnerMongoliaMedicalUniversity,InnerMongoliaHohhot010059,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the drug resistance characteristics and in vitro adhesion abilities of Acinetobacter baumannii with different genotypes， to provide the reference for further study on the relationship between the evolution of drug resistance of Acinetobacter baumannii and its adhesion ability change， and to guide infection prevention and control. MethodsPulsed field gel electrophoresis(PFGE) was used to do molecular typing for 50 isolates of Acinetobacter baumannii from different inpatients in Inner Mongolia. In vitro adhesion abilities of Acinetobacter baumannii with different genotypes were detected by fibronectin adherence assay. ResultsThe 50 isolates had 22 PFGE genotypes， among which A and E types were the advantageous types, and the rates were 22%(11/50)and 24%(12/50)， while the isolates with L type were resistant to all tested antibiotics, and the drug resistance of the isolates belonging to the remaining genotypes were significantly different. The isolates of A type were mainly isolated from 2 regions, Xing′an Meng and Chifeng City. The isolates of E type were all isolated from Hohhot. Fibronectin adherence assay showed that the isolates with G type and J type showed the highest in vitro adhesion ability， while the isolates with J type were sensitive to all tested antibiotics, and the isolates with D type showed the lowest in vitro adhesion ability, only being resistant to carbapenem. ConclusionsThe genotypes of Acinetobacter baumannii isolated from Inner Mongolia show diverse features， which seems to be specific with different districts. There is no significant correlation between the drug resistance acceleration of Acinetobacter baumannii and its in vitro adhesion abilities.

Key words:Acinetobacter baumannii; Drug resistance; Pulsed field gel electrophoresis; Molecular typing; In vitro adhesion ability

鮑曼不動桿菌是一種非發酵糖、氧化酶陰性、無動力的革蘭陰性桿菌，廣泛分布于自然界、醫院環境等，是引起醫院感染的一種重要的條件致病菌。近年，我國住院患者中鮑曼不動桿菌的分離率和耐藥率均呈逐年上升趨勢，對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率達57%以上[1]。新德里金屬β-內酰胺酶(New Delhi metallo-beta lactamase 1, NDM-1)超級耐藥細菌的出現[2]，使各國醫療機構對鮑曼不動桿菌耐藥性及其致醫院感染的重視程度進一步增強。但耐藥性不斷增加的同時，鮑曼不動桿菌致病力是否相應增加尚不明確。鮑曼不動桿菌致病力的強弱不僅與宿主易感性相關，還與其侵襲力密切相關。作為鮑曼不動桿菌侵襲宿主的第一步，黏附能力的強弱決定其后續的生物膜形成、侵入宿主細胞等致病過程[3]。但針對不同鮑曼不動桿菌體外黏附等致病特征與其耐藥性之間的相關性研究報道甚少。因此，本研究擬以內蒙古不同地區住院患者分離的鮑曼不動桿菌為研究對象，采用脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis， PFGE)進行分子分型，分析不同地區分離株基因型及耐藥特征是否呈現特征性分布；同步采用體外黏附試驗檢測不同基因型鮑曼不動桿菌體外黏附能力的變化，分析不同耐藥表型分離株體外黏附能力是否存在差異，為更好地防控和治療多重耐藥鮑曼不動桿菌醫院內感染提供新的試驗數據和思路。

材料和方法

一、菌株來源

收集2011年11月至2013年10月從臨床標本中分離的鮑曼不動桿菌50株，其中來自分泌物24株、痰液9株、膿液8株、尿液4株、血液3株、肺泡灌洗液1株、咽拭子1株。地區分布為內蒙古中部呼和浩特市22株，東部赤峰市9株，東北部呼倫貝爾市11株、興安盟8株。所有入選菌株均經VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定系統進行重新鑒定。

二、主要試劑

PFGE使用膠為SeaKem@Gold Agarose低熔點瓊脂糖膠(Bio-Rad公司，美國)；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；革蘭陰性菌鑒定卡(GN Card)及革蘭陰性細菌藥物敏感性卡片(AST-GN16 Card)購自法國生物梅里埃公司。

三、主要儀器

VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統為法國生物梅里埃公司產品。PFGE儀為美國伯樂Bio-rad CHEF DRⅢ，凝膠成像系統為美國伯樂Bio-rad Gel Doc XR，PFGE圖譜分析軟件采用BioNumerics V 5.1版本。

四、方法

1. 細菌鑒定及藥物敏感性試驗將收集的菌株接種于麥康凱平板上，37℃培養18～24 h，采用VITEK-2全自動微生物鑒定系統進行再次鑒定。抗菌藥物均采用革蘭陰性菌藥物敏感性卡片(VITEK-2 AST-GN16卡)進行檢測。藥物敏感性試驗結果參照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2013版本M100-S23文件進行判定，質控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)。

2. PFGE分型菌株復活后， 挑取新鮮單個菌落接種至LB培養基中，37℃孵育18～24 h，刮取適量細菌，懸濁于細胞菌懸液中。調整細胞懸液濃度，用比濁儀(bioMerieux Vitek colorimeter)測其濃度至4.0～4.5麥氏單位。取400 μL菌懸液和20 μL蛋白酶K(儲存液濃度為20 mg/mL)37℃水浴中孵育后與等體積的1%Seakem Gold混合制膠。用細胞裂解液和蛋白酶K進行細菌的裂解，再用水和三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液沖洗膠塊。切膠，酶切(ApaⅠ，TAKARA)，37℃水浴4 h。電泳參數為138 mA，脈沖時間為5～40 s，電泳時間18 h。電泳結束后用GelRed染劑染色，然后進行凝膠成像系統觀察并拍照。

3. 纖維黏連蛋白黏附試驗試驗前1天用人纖維黏連蛋白10 μg/mL包被96孔細胞培養板，4℃過夜孵育，經磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)(牛血清白蛋白1%)洗滌2次，再取牛血清白蛋白溶液125 μL 37℃封閉1 h，經PBS洗滌3次。將待檢鮑曼不動桿菌常規接種于羊血瓊脂培養基，37℃孵育過夜，重懸于PBS中，調整濃度至1麥氏單位。取62.5 μL菌懸液和等量PBS混合，加入包被的96孔細胞培養板中，37℃孵育2 h，經PBS洗滌4次去除未黏附細菌，之后加入0.5% Triton X-100，室溫30 min，取1 μL接種麥康凱培養基，37℃孵育24～48 h，人工計數細菌菌落，以細菌菌落數的多少反映每株鮑曼不動桿菌黏附能力的強弱。

結果

一、體外藥物敏感性試驗

50株鮑曼不動桿菌體外藥物敏感性試驗結果見表1。

二、PFGE分型

PFGE后，經ApaⅠ酶切，按照相似度90%分為22種基因型和29種亞型：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V。A和E型為優勢帶型，分別占22%(11/50)和24%(12/50)；L型對所有受試的抗菌藥物均耐藥，其余基因型耐藥表型差異明顯，見圖1。優勢型A型菌株共11株，主要分布在東北部地區興安盟和赤峰市(81.82%，9/11)；優勢型E型菌株共12株，則主要分布在中部地區呼和浩特市(11/12)。

表1　50株鮑曼不動桿菌藥物敏感性試驗結果

注：MIC為最低抑菌濃度

圖1　50株鮑曼不動桿菌PFGE分型

根據PFGE分型，優勢基因型A型對一代和二代頭孢類抗菌藥物、阿莫西林-克拉維酸、環丙沙星、呋喃妥因、氨芐西林和氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥率最高，為100%；對亞胺培南和哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率最低，為0%；對復方磺胺甲噁唑、左氧氟沙星和替加環素的耐藥率分別為91%、45%和27%。優勢基因型E型對阿莫西林-克拉維酸、環丙沙星、氨芐西林和氨曲南的耐藥率最高，為100%；對替加環素的耐藥率最低，為33%；對頭孢唑啉、頭孢西丁、慶大霉素、左氧氟沙星、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢曲松、呋喃妥因、亞胺培南、復方磺胺甲噁唑、妥布霉素和頭孢吡肟的耐藥率在兩者之間，但均在50%以上。見圖2。

注：R表示耐藥；I表示中介；S表示敏感

圖22種主要基因型鮑曼不動桿菌耐藥特征

三、體外黏附試驗

黏附試驗結果顯示，體外黏附能力最強的菌株歸屬于PFGE G型(A19)和J型(A30)，前者僅對頭孢菌素類和阿莫西林-克拉維酸耐藥，后者對所有受試抗菌藥物均敏感；黏附能力最弱的菌株為PFGE D型(A41)，僅對亞胺培南敏感。見圖3。

圖3　黏附試驗人工計數細菌菌落數

討論

鮑曼不動桿菌是目前我國住院患者中分離率最高的病原菌之一，且其耐藥性呈不斷增長趨勢。從我國CHINET耐藥監測數據來看，各地分離的鮑曼不動桿菌對除米諾環素和頭孢哌酮-舒巴坦外的大多數抗菌藥物的耐藥率均在50%以上，特別是對碳青霉烯類藥物。鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2007年的37.6%和42.7%分別上升至2012年的57%和61%[4-5]。究其原因，鮑曼不動桿菌可以通過多種途徑對抗菌藥物產生耐藥[6]。因此，近年針對鮑曼不動桿菌的研究大多集中在其耐藥機制方面[7-8]，但對鮑曼不動桿菌致病力及致病機制的研究相對較少。

有研究顯示，在鮑曼不動桿菌發揮致病力的初始階段，首先通過其外膜蛋白ompA介導細菌與纖維黏連蛋白結合，實現與細胞外基質和宿主細胞之間的黏附，為細菌進一步在組織局部定植、生長繁殖、生物被膜形成及侵入宿主細胞創造條件[9-10]。黏附的鮑曼不動桿菌通過分泌多糖蛋白復合物將自身克隆集聚包裹于其中而形成生物被膜，而被膜的屏蔽作用使細菌接觸到的抗菌藥物濃度和速度明顯降低，從而進一步介導細菌耐藥性的產生。因此，生物被膜形成被認為是鮑曼不動桿菌的主要致病機制之一，也是當前研究的一個熱點[11-12]。王國戧等[13]發現細菌一旦形成生物被膜，在體內耐藥性將大幅增加，是形成慢性持續性細菌感染的重要原因。另有研究發現，眼部分離的鮑曼不動桿菌具有明顯的體外黏附、侵入宿主細胞及生物膜形成能力[14]。提示不同來源部位菌株黏附能力等致病特征可能存在差異。纖維黏連蛋白黏附試驗是用于評估細菌體外黏附能力的常用方法，目前已在金黃色葡萄球菌等常見病原菌體外黏附特征的研究中廣泛應用。本研究所用方法在相關研究的基礎上進行了改良，試驗可重復性更好。本研究采用纖維黏連蛋白黏附試驗進一步分析不同來源及具有不同耐藥特征的鮑曼不動桿菌體外黏附能力是否存在差異，結果發現，黏附能力最強的2株菌株分離部位全部來自膿液，而最弱的株則來自尿液，黏附能力的強弱是否與分離部位有關，還需進一步試驗來明確。本研究同時發現，優勢基因型鮑曼不動桿菌的耐藥性高于非優勢型菌株，但其體外黏附能力未見相應增加。鮑曼不動桿菌耐藥性的增加與其體外黏附能力并未見明顯相關性。目前針對不同耐藥特征的鮑曼不動桿菌，體外耐藥性的變化與其致病力之間的相關性研究報道甚少。但由于本研究所選菌株例數有限，為進一步證實鮑曼不動桿菌耐藥性演變與其致病力變化之間的相關性，更加深入的多中心、大樣本研究有待進一步開展。

本研究PFGE分子分型結果發現內蒙古地區分離的鮑曼不動桿菌基因型呈現多樣性，特定基因型菌株具有相同或相近的耐藥特征，且呈現一定的地區分布特點。如A型優勢株中編號為16、18、24、25、38、40、43、45的菌株具有相同的耐藥特征，且均分布在內蒙古東北地區；E型優勢株中編號為1、4、5、7、12、13、47的菌株耐藥特征相同，分布在呼和浩特地區。A型中的2種亞型AⅠ和AⅡ在PFGE結果中顯示僅有1條條帶的不同，反映到耐藥特征上也稍有差異。如A45和A36對替加環素的MIC值分別為4和2 μg/mL。對PFGE優勢型A型和E型的菌株隨機選擇3～4株進行多位點序列分型[15]，結果顯示A型和E型分別歸屬于ST92和ST208型。ST92和ST208均屬于歐洲克?、蚝涂寺秃象w92(CC92)，而CC92是世界范圍內流行最廣泛的克隆復合體[16]。有研究顯示，歐洲克?、蛐途甑酿じ侥芰娪冖裥停疑锉荒ば纬赡芰σ哂冖裥?，基因組的重排、代謝能力以及環境因素的影響，可能造成不同克隆株之間的致病潛力出現差異[17]。不同地區分離流行株的生物學特性尚需進一步研究，特別對于耐藥性和毒力特征的演變，以便更好地指導特定地區分離株的感染防控和治療。

綜上所述，內蒙古地區鮑曼不動桿菌臨床分離株基因型呈多樣化，不同基因型菌株耐藥譜差異明顯。本研究結果初步揭示了不同基因型鮑曼不動桿菌體外黏附能力存在明顯的差異，可能與菌株分離部位存在一定相關性。但菌株耐藥性的增加與其體外黏附能力的特征并未見明顯相關性。由于本研究所選菌株有限，關于鮑曼不動桿菌耐藥性變化與其致病力之間的相關性尚需進一步研究，以便為臨床上更好防控及治療多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌感染提供理論依據，降低耐藥菌株的傳播。

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(本文編輯：姜敏)

2015年《檢驗醫學》舉辦“檢驗醫學新技術”國家級繼續教育項目的通知

為滿足全國檢驗醫學工作者對繼續教育的需求，充實基礎理論知識、促進檢驗醫學水平、提高教學和科研質量，節省有關檢驗醫學工作者接受繼續教育的費用和時間，在期刊編委專家們的積極支持下，經國家繼續教育委員會批準，《檢驗醫學》將于2015年度舉辦“檢驗醫學新技術”[Ⅰ類10分，項目編號：2015-11-00-281 (國)，由上海市臨床檢驗中心主辦]國家級繼續教育項目。具體實施方案如下：

1. 學員對象具有中級或中級以上專業技術職稱、正在從事醫學檢驗或其他相關專業技術工作的衛生技術人員均可參加。

2. 繼續教育內容臨床檢驗與血液學檢驗、免疫學檢驗、微生物學檢驗、生物化學檢驗、分子生物學檢驗、實驗室管理等檢驗醫學領域的新技術、新進展，均出自期刊發表的文章。

3. 學員報名步驟欲參加繼續教育項目者，請將回執(見第488頁)復印、填寫后寄回(回執請務必填寫完整，信封上注明“參加繼續教育”)；也可以登錄期刊網站(http://www.shjyyx.com)，在“編輯部公告”中下載、填寫回執，并將回執用E-mail(該E-mail地址請與回執中填寫的一致)發回；或登錄上海市臨床檢驗中心網站(www.sccl.org.cn)直接報名參加。編輯部以收到學員報名的回執和教育費用的次序作登記注冊和編號。

4. 考試方法編輯部將試卷寄給注冊過的學員(試卷復印無效)，考試合格者參照國家《繼續教育學分授予方法》授予繼續教育學分證書。編輯部將依據學員報名登記、注冊編號、交費記錄和考試成績寄發學分證書。

5. 時間安排2015年4月1日至10月30日。

6. 收費標準300元。

讀者如有疑問，請咨詢期刊編輯部。

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上海市臨床檢驗中心《檢驗醫學》編輯部

2015年4月

收稿日期：(2014-07-09)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0468-06R446.5

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.015

通訊作者：張軍力，聯系電話：0471-6637610。

作者簡介：塔拉，女，1988年生，學士，主要從事臨床檢驗診斷學研究。