尿兒茶酚胺LC-MS/MS檢測方法的建立

彭穎斐，　吳　炯，　郭　瑋，　陳方俊，　秦嘉倩，　徐　雯，　潘柏申

尿兒茶酚胺LC-MS/MS檢測方法的建立

彭穎斐，吳炯，郭瑋，陳方俊，秦嘉倩，徐雯，潘柏申

(復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032)

摘要：目的建立尿液兒茶酚胺[包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)]的液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測方法。方法以E-d3、NE-d6和DA-d4鹽酸鹽為內標，采用WATERS ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)進行分離。流動相A1為2 ‰甲酸水溶液，流動相B1為甲醇(純度為99.9%)，流速為0.5 mL/min，按A1∶B1=95∶5等度洗脫。采用電噴霧(ESI)正離子模式進行質譜分析。對方法的線性、準確度(回收率)、不精密度及最低檢出限等進行性能驗證。選取表面健康人群65名，建立E、NE和DA的參考區間。結果采用建立的LC-MS/MS檢測尿液E、NE和DA，保留時間分別為0.58、0.89和0.63 min，檢測范圍為0.50～800.00 ng/mL。E、NE和DA的加標平均回收率分別為97.95%、97.78%和101.03%，最低檢出限分別為0.25、2.50和2.50 ng/mL。E、NE和DA的參考區間分別為5.4～25.8、 28.5～73.1和269.1～420.5 μg/24 h。結論建立的LC-MS/MS方法能同時檢測尿液中的E、NE和DA，可為嗜鉻細胞瘤的診斷提供可靠的信息。

關鍵詞：腎上腺素；去甲腎上腺素；多巴胺；尿液；液相色譜-串聯質譜

Establishment of a LC-MS/MS for the determination of urinary catecholaminesPENGYingfei，WUJiong，GUOWei，CHENFangjun，QINJiaqian，XUWen，PANBaishen

.(DepartmentofClinicalLaboratory，ZhongshanHospital，FudanUniversity，Shanghai200032，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) for the determination of urinary catecholamines， including epinephrine(E)， norepinephrine(NE) and dopamine(DA). MethodsE， NE and DA were separated by WATERS ACQUITY UPLC?HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm column) using E-d3， NE-d6 and DA-d4 as internal standards. The mobile phase consisted of 2‰ formic acid aqueous solution (A1) and methyl alcohol (B1, purity=99.9%). The flow rate of 0.50 mL/min was applied to the chromatographic column. Flow starting was performed with A1∶B1=95∶5. Electrospray ionization (ESI) was operated in positive ion mode. The LC-MS/MS was used， with linearity， accuracy (recovery rate)， imprecision and lower limit of determination being evaluated. A total of 65 healthy subjects were enrolled, and the reference ranges for E, NE and DA were established. ResultsThe retention times of E， NE and DA were 0.58， 0.89， 0.63 min， respectively. The determination range was from 0.50 ng/mL to 800.00 ng/mL. The mean recovery ranges were 97.95%， deter mination range 97.78% and 101.03%. The lower limits of determination for E， NE and DA were 0.25， 2.50 and 2.50 ng/mL. The reference ranges were 5.4-25.8 μg/24 h for E， 28.5-73.1 μg/24 h for NE and 269.1-420.5 μg/24 h for DA. ConclusionsThe LC-MS/MS for the simultaneous determination of E, NE and DA has been established and is suitable for clinical application. It can provide reliable information for the diagnosis of phaeochromocytoma.

Key words:Epinephrine； Norepinephrine； Dopamine： Urine； Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

尿液兒茶酚胺[包括腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)和多巴胺(dopamine，DA)]的檢測結果對于嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤這類分泌兒茶酚胺的腫瘤的診斷具有重要意義。盡管現在許多研究推薦檢測血液中甲氧基腎上腺素和去甲甲氧基腎上腺素，但尿液兒茶酚胺類物質的檢測仍然應用普遍。由于兒茶酚胺類物質都是微量存在的(一般為ng/mL級)，且極易受到樣本氧化的干擾，因此對兒茶酚胺類物質的精確定量就需要一個靈敏度和特異性都很好的方法。目前兒茶酚胺類物質多用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)電化學法檢測，但存在標本前處理時間長、檢測時間長、存在共洗脫復合物干擾等問題[1-3]。

隨著分析技術的不斷進步，液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)走進了臨床化學的檢測領域，它具有檢測時間短、樣本用量小、靈敏度和特異性均高的優點。我們旨在建立檢測尿液E、NE和DA的LC-MS/MS方法，以替代現有的HPLC方法，并對自建的LC-MS/MS的可靠性進行驗證。

材料和方法

一、材料

1. 儀器Waters?XevoTMTQ MS ACQUITY UPLC?LC-MS/MS檢測系統。WATER SACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫30℃。Labconco 低溫真空離心濃縮儀。

2. 試劑標準品E鹽酸鹽、NE鹽酸鹽和DA鹽酸鹽購自美國Sigma公司；內標品E-d3、NE-d6和DA-d4鹽酸鹽購自美國Medicalisotopes公司；甲醇購自德國Merck公司；甲酸購自美國Roe Scientific公司。試驗用水由Milli Q純水儀制備。所有試驗用化學品和溶劑均為色譜級。

3. 耗材Waters Oasis弱陽離子交換96孔固相抽提(solid-phase extraction， SPE)板和提取物收集板。

4. 對象選取2013年9月到2014年7月復旦大學附屬中山醫院表面健康人群65名，男32名，女33名，年齡25～63歲。

二、方法

1. 工作液制備和質控品標準品E鹽酸鹽、NE鹽酸鹽和DA鹽酸鹽的工作液采用0.1 mol/L鹽酸溶液配制，濃度范圍為0.2～800.0 ng/mL，-20℃儲存。空白尿液為常規尿液在堿性條件下100℃煮沸，再調節pH值至4.0。生化尿液質控品購自伯樂公司。

2. 樣本收集收集24 h尿液，防腐劑為6 mmol/L鹽酸，-20℃凍存。

3. 樣本前處理分別將尿液、標準品、內標品取出平衡至室溫。(1)患者樣本：取患者尿液480 μL，加入內標20 μL，混勻，10 000×g離心1 min；(2)標準品：取空白尿液460 μL，加入標準品20 μL，再加入內標20 μL，混勻，10 000×g離心1 min。尿液樣本和標準品使用Waters Oasis弱陽離子交換96孔SPE板進行抽提和萃取。每孔預先使用甲醇(純度99.9%)和水各200 μL進行潤洗，之后加入混合有內標的500 μL樣本(尿液或標準品)進行抽提和萃取，之后加入水和甲醇(純度99.9%)各200 μL，分別將親水、親有機相以及不同極性的雜質洗脫，最后使用2次50 μL 2%甲酸乙腈溶液進行洗脫，將目標分析物以及同位素內標洗脫入樣本收集管。將收集的樣本放入低溫真空離心濃縮儀凍干，檢測時用100 μL水復融。

4. 色譜條件流動相A1為2 ‰甲酸水溶液，流動相B1為甲醇(純度99.9%)；流速為0.5 mL/min。按A1∶B1=95%∶5%等度洗脫。

5. 質譜分析將萃取得到的樣品上機檢測，每次進樣量為20 μL。離子化模式為電噴霧(electrospray ionization，ESI)正離子模式。質譜儀設置參數見表2。

表1　質譜檢測參數設置

三、方法學驗證

參照《化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則》[4]對自建的LC-MS/MS進行基本分析性能驗證。

1. 不精密度和準確度分析所用的低濃度(E：10.1～20.3 ng/mL；NE：33.0～55.0 ng/mL；DA：48.2～81.9 ng/mL)和高濃度(E：65.9～101.0 ng/mL；NE：161.0～247.0 ng/mL；DA：394.0～654.0 ng/mL)質控品為伯樂尿液生化質控品。(1)批內不精密度：批內不精密度和準確度需要通過對質控樣品重復5次分析后方可評估，不精密度可由變異系數(coefficient of variation，CV)評價，可通過檢測出的濃度數值計算得到，不精密度(%)=標準偏差÷平均檢測濃度×100。準確度是基于計算平均測定濃度和標示濃度的百分比偏差而評價的。偏差(%)=(平均檢測濃度-標示濃度)÷標示濃度×100。偏差必須落在±15% (檢測下限為±20%)之內，不精密度必須≤15%(定量下限≤20%)方能達到檢測要求。(2)批間不精密度：批間不精密度和準確度的評價需要連續3 d對質控樣品重復5次分析，得到3條獨立的標準曲線。各濃度水平的質控品與批內不精密度的設定相同。偏差必須落在±15% (檢測下限為±20%)之內，不精密度必須≤15%(定量下限≤20%)方能達到檢測要求。

2. 定量下限定量下限(lower limit of quantitation，LLOQ)是指由特定的分析步驟能夠精確且準確檢測出的最低濃度。定量下限的有效偏差為±20%以內，且CV需≤20%。

3. 相對回收率在同一尿液標本中分別加入濃度為2、40和200 ng/mL的E、NE、DA。按樣本前處理方法操作，測定加入前、后尿液E、NE、DA濃度。相對回收率為E、NE、DA增加濃度與加入濃度的比值。提取回收率在80%～120%之間判斷為可接受。

4. 線性評估和標準曲線的建立選取7個濃度的標準品，每個濃度分裝6份，連續檢測6 d。

四、參考區間建立

檢測65名表面健康人群的尿液E、NE和DA濃度，取雙側95百分位數值作為參考區間上、下限，建立參考區間。

五、統計學分析

采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、分離條件優化

1. 流動相中有機溶劑對保留時間的影響按照流動相A1和B1的不同比例，對標準工作溶液進行分析，結果發現被測物和內標的保留時間隨著甲醇比例的增加而縮短，但變化程序逐漸減小，當甲醇比例為95%時，保留時間較短且彼此能較好分離。故確定流動相為2‰甲酸水溶液∶甲醇=95%∶5%。

2. 柱溫對保留時間的影響將標準工作溶液在不同柱溫下分析，隨著柱溫的增加，保留時間相應縮短，當柱溫為30℃時，E、NE、DA能較好的分離，且分析時間適中。故確定柱溫為30℃。

二、檢測尿液E、NE和DA的LC-MS/MS的建立及性能驗證

1. LC-MS/MS檢測E、NE和DA的色譜圖E(m/z 184.0→166.0)及其內標物E-d3(m/z 187.0→169.0)的保留時間均為0.63 min；NE(m/z 152.0→107.0)及其內標物NE-d6(m/z 158.0→111.0)的保留時間分別為0.58和0.57 min；DA(m/z 154.0→137.0)及其內標物DA-d4(m/z 158.0→141.0)的保留時間分別為0.89和0.88 min。見圖1。

2. 線性評估和標準曲線的建立LC-MS/MS檢測E、NE、DA在0.50～800.00 ng/mL內均呈線性，線性評估相關系數(r2)均>0.99，見表3。

3. 準確度E的回收率為93.1%～102.1%，平均為97.95%；NE的回收率為92.2%～104.4%，平均為97.78%；DA的回收率為96.2%～105.4%，平均為101.03%。均符合回收率80%～120%的標準。

注：(a)E(m/z 184.0→166.0)；(b)E-d3(m/z 187.0→169.0)；保留時間均為0.63 min

圖1E及其內標E-d3的色譜圖

注：(a)NE(m/z 152.0→107.0)，保留時間為0.58 min；(b)NE-d6(m/z 158.0→111.0)，保留時間為0.57 min

圖2NE及其內標NE-d6的色譜圖

注：(a)DA(m/z 154.0→137.0)，保留時間為0.89 min；(b)DA-d4(m/z 158.0→141.0)，保留時間為0.88 min

圖3DA及其內標DA-d4的色譜圖

4. 不精密度LC-MS/MS檢測E、NE和DA不精密度(CV)均<15%，滿足要求。見表3。

5. LLOQLC-MS/MS檢測E、NE和DA的LLOQ[信噪比(signal-noise ratio, S/N)=10∶1]分別為0.25、2.50和2.50 ng/mL。CV分別為13.24%、10.14%、9.26%，偏差分別為18.5%、15.4%、16.5%。

表2　LC-MS/MS檢測E、NE和DA的線性評估(ng/mL)

表3　LC-MS/MS檢測E、NE和DA的不精密度

三、參考區間的建立

采用LC-MS/MS檢測65名健康體檢者尿液E、NE和DA。由于3項指標的檢測結果均呈正態分布，因此取雙側95百分位數值作為參考區間上、下限。E的參考區間為5.4～25.8 μg/24 h、NE的參考區間為28.5～73.1 μg/24 h，DA的參考區間為269.1～420.5 μg/24 h。

討論

尿液兒茶酚胺檢測是診斷嗜鉻細胞瘤的一項重要生化指標。在過去的許多年里，許多報道證明HPLC和免疫分析等方法檢測尿兒茶酚胺代謝產物能夠提高嗜鉻細胞瘤診斷的靈敏度和特異性。目前常用的檢測方法有熒光法、放射酶學測定法、放射免疫測定法和HPLC。前3種方法因試劑價格昂貴、步驟繁瑣，因而增加了檢驗難度，且準確性較差；HPLC雖然測定較為準確，但仍存在標本流動相配置復雜，檢測時間長，最低定量下限較高等問題[1，5]。

BICKER等[5]對液相色譜法檢測各種類型標本中兒茶酚胺及其代謝產物的優缺點進行了總結。采用LC-MS/MS檢測尿兒茶酚胺與HPLC進行比較，可以得出以下優點：(1)檢測時間縮短：HPLC單個樣本的檢測時間一般為10 min左右[6]，而LC-MS/MS 在1 min內即可完成檢測；(2)所需樣本量少：HPLC檢測所需樣本量一般為1 mL左右，甚至更多，而LC-MS/MS僅需460 μL即可完成檢測；(3)靈敏度高：HPLC檢測E的最低檢出限一般為1 ng/mL以上[5]，而LC-MS/MS由于使用配對離子對檢測物質結構本身，所以檢測的敏感性和特異性有所提高，本研究自建方法的最低檢出限為0.25 ng/mL，較HPLC有了很大的提高。

本研究還初步建立了健康人尿液E、NE和DA的參考區間，結果分別為5.4～25.8、28.5～73.1和269.1～420.5 μg/24 h。DE JONG等[1]使用了與本研究相同的儀器和檢測模式，得出的參考區間為E：15～104 nmol/24 h(2.75～19.00 μg/24 h)；NE：139～592 nmol/24 h(23.5～100.0 μg/24 h)；DA：702～2 803 nmol/24 h(107.4～428.8 μg/24 h)。該結果與本研究結果類似。

綜上所述，本研究建立了可靠的檢測尿液兒茶酚胺的LC-MS/MS方法，能同時檢測尿液中的E、NE和DA濃度，采用同位素內標法定量，操作簡便，分析時間短，樣本用量少，靈敏度和特異性較高，適用于臨床嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤這類分泌兒茶酚胺腫瘤的輔助診斷。

參考文獻

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(本文編輯：龔曉霖)

收稿日期：(2015-01-31)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0433-04R446.1

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.006

通訊作者：潘柏申，聯系電話：021-64041990-2376。

作者簡介：彭穎斐，女，1985年生，學士，技師，主要從事臨床檢驗工作。

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃資助項目(2012BAI37B01)；國家臨床重點檢驗專科建設資助項目