質譜分析在遺傳代謝性疾病臨床檢驗診斷中的應用

張春花

質譜分析在遺傳代謝性疾病臨床檢驗診斷中的應用

張春花

(日本國際松本生命科學研究所，日本 金澤 921-8105)

摘要：質譜分析技術已被公認為是代謝性疾病化學診斷的有用手段。氣相色譜質譜聯用法可以對130余種代謝疾病進行篩查和化學診斷，串聯質譜法可同時篩查30余種脂肪酸代謝異常疾患和部分氨基酸代謝異常，因而被世界各國廣泛用于新生兒先天性代謝疾病的篩查。應用質譜分析技術分析診斷遺傳代謝疾病的實驗室逐年遞增，但其實驗操作較為繁雜。臨床實驗室國際標準化管理是保證質譜分析技術為臨床檢驗服務的前提。網絡化實驗室體系可以簡化實驗室的操作，保證良好的實驗室管理。

關鍵詞：質譜；代謝性疾?。粴庀嗌V質譜聯用；串聯質譜

Application of mass spectrometry for the clinical diagnosis of inborn error of metabolismZHANGChunhua

.(MatsumotoInternationalInstituteofLifeScience，Kanazawa912-8105，Japan)

Abstract:For the clinical diagnosis of inborn error of metabolism, the technique of mass spectrometry is considered to be an important tool. Gas chromatography/mass spectrometry can be used in the screening and diagnosis of more than 130 inborn errors of metabolism. Tandem mass spectrometery can screen about 30 fatty acid disorders and amino acid disorders, so it is applied into neonatal screening around the world. The number of laboratories using mass spectrometry for the diagnosis of inborn error of metabolism is increasing, but the organization of mass spectrometry analysis is very difficult. Internationalization management is the precondition for the quality control of inborn error of metabolism determination in clinic. The on-line mass spectrometry network system can overcome difficult procedure and keep high quality for laboratory management.

Key words:Mass spectrometry； Inborn error of metabolism； Gas chromatography/mass spectrometry； Tandem mass spectrometry

自1902年英國Garrod教授發現尿黑酸尿癥以來，先天性代謝性疾病逐漸被認知。目前，全世界已發現了500余種先天性代謝疾病。這些疾病的整體發病人數雖多，但是每一種疾病的發病率相對較低，其臨床表現缺乏特異性，導致臨床診斷依賴于特殊實驗室的檢查數據。根據這類疾病的發病機制(由于體內生化代謝中的酶催化反應受損導致體內代謝紊亂，從而繼發臨床癥狀)的特點，其相應的特殊檢驗方法需要盡可能的滿足同時監測全面的代謝產物的紊亂狀態，從而推測出代謝紊亂誘發的反應阻滯環節，得出反應異常酶的靶向定位。但長期以來，一般醫院的實驗室無法實現對上述代謝紊亂的監測，先天性代謝疾病的診斷也長期處于檢驗手段不完善的狀態之下。20世紀60年代初期開始的層析加質譜分析技術的代謝組學研究和醫學應用恰好對上述代謝病的檢測需求作了補充。隨著近年來對疾病譜研究的深入和分析儀器設備技術的更新，質譜分析在醫學檢驗領域中的應用不斷得到擴展。在此對行代謝性疾病質譜分析的醫學實驗室的實際配置應用和管理方面進行闡述。

一、質譜技術在醫學應用領域中的發展歷史

最近10余年以來，質譜分析在醫學臨床診斷和研究方面變得非常普遍。提及質譜分析，會聯想到“氣相色譜質譜聯用”、“串聯質譜”、“遺傳代謝病”、“新生兒篩查”、“維生素D”、“兒茶酚胺”、“藥物濃度監測”等一系列關聯詞，甚至在醫學檢驗領域中，液相串聯質譜被視為新時代檢驗的核心技術。臨床醫生在多種臨床疑難或遺傳性疾病診斷方面出現了一種過度依賴于質譜分析的傾向。事實上，質譜分析技術在醫學檢驗領域中的應用已有將近40年的歷史。

1966年，TANAKA博士[1]采用氣相色譜質譜聯用(gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS)技術對患者的尿液和血液進行分析，初次發現了異戊酸血癥。這個發現提示了質譜分析技術可以用于醫學臨床診斷。20世紀70年代初期，國際上開始采用GC/MS對先天性代謝疾病的診斷進行研究。1973年日本著名遺傳代謝病學者MATSUMOTO等[2]首先創建了有機酸血癥的GC/MS分析法，作為有機酸血癥的獨特的診斷方法為100余種先天代謝病的臨床診斷提供了有力的參考依據。1993年，作者參與MATSUMOTO等的研究小組對原有機酸血癥的GC/MS分析法做了改良，提出了尿素酶前處理法的新的遺傳代謝病化學診斷體系。新的體系不僅能診斷有機酸血癥，同時還可以檢出氨基酸血癥、糖代謝病、脂肪酸、核酸代謝疾病，擴大了GC/MS技術在先天性代謝疾病診斷方面的應用范圍[3-5]。目前，在日本松本生命科學研究所(Matsumoto International Institute of Life Science，MILS)，經過MATSUMOTO等學者40余年的研究，現已能通過尿液分析對130余種先天代謝病進行篩查[6-9]，為兒童遺傳代謝病的診斷和治療提供了重要的參考依據，同時為遺傳代謝病的分子診斷學研究提供了絕佳的導航效應，促進了世界性的遺傳代謝病研究。同期美國物理學家MILINGTON等[10]應用串聯質譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)法，通過檢測干燥濾紙血斑中的脂酰肉堿診斷20余種脂肪酸代謝異常疾病。之后RASHED等[11]和CHACE等[12]對該技術進行了改良，在分析干燥濾紙血斑中的脂酰肉堿的同時聯合氨基酸分析可同時篩查脂肪酸代謝異常和部分氨基酸代謝異常。這個方法的建立推動了全球性的新生兒篩查。通過近20年的基礎研究，MS/MS法新生兒篩查幾乎普及到了全世界。近10年以來，聯合GC/MS、MS/MS、電泳層析色譜質譜聯用(capillary electrophoresis/mass spectrometry，CE/MS)、飛行時間質譜(time-of-flight mass spectrometry，TOF-MS)技術對體液和組織進行分析，綜合所有檢測信息對生物體的代謝組學及蛋白組學進行研究的手段更得到了醫學和藥學界學者的矚目，特別是在未知病態的病因病理學解析、診斷生物指標的探索、經驗醫學的數字化量化解析、藥物治療效果的評估等方面，質譜分析的代謝組學以及蛋白組學研究可列為最前沿的研究技術[13-14]。

二、質譜分析在遺傳代謝病檢查中的應用現狀

隨著儀器廠商不斷改進技術，質譜儀的操作已相對簡單，但在作為常規臨床檢驗儀器應用方面與目前檢驗科正在使用的自動生化分析儀等大型自動化儀器相比還存在著諸多操作、維護及穩定性方面的問題。因此，很多質譜分析儀器尚未取得醫療分析儀器的認證。大部分的質譜儀都由專業人員進行操作和管理，其用途也多用于研究和特定項目檢測。目前，在實際臨床應用中相對比較成熟的遺傳代謝性疾病質譜檢測技術主要為MS/MS和GC/MS。

1. MS/MS技術MS/MS技術是利用液相層析原理加上雙重質譜分析實現快速分析含有同樣官能基結構的同類化合物的目的。目前，MS/MS技術主要用于檢測血清或濾紙血斑中的酰基肉堿成分及氨基酸成分，對20多種遺傳代謝病進行篩查。該方法的優點是標本處理簡單、檢測所需時間短(每份標本只需2 min)、可通過一定參數的變動判斷結果，可快速推測篩查對象疾病的可疑性；缺點是其結果易受多種因素影響，容易產生假陽性，且其結果大部分需借助尿液GC/MS分析等其他分析手段來確認。

2. GC/MS技術GC/MS技術的原理是利用氣相層析加質譜技術對可氣化的物質進行定性和定量檢測、分析樣本采集時的代謝產物組學。GC/MS技術目前主要用于分析尿液中100～300種代謝成分，對30～130多種異常代謝病診斷線索的有無進行篩查。GC/MS技術的優點是作為代謝性疾病診斷的輔助手段進入醫學臨床應用歷史較長，其技術得到了長時間驗證和改良，同時在世界性的遺傳代謝性疾病的研究和病例數據積累方面有較為堅實的參照基礎，并可通過代謝產物的分析組合提升對新的遺傳代謝疾病的認知；其缺點是標本的氣化衍生前處理過程相對繁瑣，標本前處理的方法和人為操作會影響結果，檢測時間較長(每份標本需20～60 min)，結果判斷需要數據解讀人員掌握全部代謝成分的質譜特征，理解正常代謝譜的分布狀態和可變動范圍，識別代謝紊亂的代謝異常環節和位點，在此基礎上做出代謝分析的結果判斷和異常提示。該分析結果一部分非常接近于臨床診斷，一部分需要借助臨床其他檢查和分子生物學檢測確認診斷，還有一部分是對臨床疾病的異常代謝組學的解釋。因此，對該結果的使用和理解需結合遺傳代謝性疾病專家的意見、臨床患者資料及用藥資料綜合進行[15]。

三、遺傳代謝病質譜分析的實驗室管理

雖然質譜技術在遺傳代謝病研究和診斷方面已經有很久的歷史，但目前尚無完善的實驗室標準化管理流程。大部分實驗室依靠常年的經驗來實現送檢標本的檢測分析和結果判斷，并提供該實驗室的檢測報告。因此常常會出現代謝病患者雖然采用質譜分析進行代謝病篩查，但未能明確診斷，進而導致醫療糾紛的案例。這也是該技術和該項目發展成熟期不可避免的弊端。中國的遺傳代謝病質譜分析在20世紀90年代末期開始開展，2003年以后在北京、上海、廣州、武漢等地逐漸開設了GC/MS和液相色譜-質譜/質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS)分析實驗室。截至到2013年，已經注冊的質譜分析實驗室已達40余家。各實驗室使用的儀器設備不同，標本的前處理方法有差異，數據分析有依賴軟件操作和技術人員人工判讀兩種方式。因此出現了同一患者持有不同的質譜分析實驗室的檢測報告到處求醫會診的現象。由于各實驗室的結果各不相同，患者及家屬困惑，臨床醫生也困惑。最近作者常常收到不同實驗室發來的患者檢查結果的郵件，希望對其檢查結果給出綜合意見。在處理和應對這些咨詢郵件的同時我們強烈感覺到需要糾正和理順代謝病質譜分析的無標準化操作的現狀。建議質譜分析實驗室參照以下標準規范遺傳代謝病的篩查。

1. 標本采集、保存和轉運用于代謝病分析的常規標本有血液和尿液2種。為了保證有效、準確的檢測結果，標本的采集方法、采集時間、保存條件及標本傳遞過程中的注意事項非常重要。質譜分析主要對標本采集時的代謝成分的存在狀態(質和量)進行檢測，因此標本采集時間的選擇一定要嚴格遵照檢驗單的要求。固化標本采集時的代謝成分狀態、中止已采標本內各種酶反應和異構體轉化的最佳方式是迅速冷凍，因此代謝病篩查標本多采用-20℃保存。標本轉運過程中需注意標本間的污染、環境污染及冷凍溫度控制，同時保持獨立標本放置空間，避免該標本對外的病原學感染。實驗室接收標本時要嚴格按上述條件確認標本保存狀態是否合格。

2. 標本處理方法目前用于代謝病篩查標本的處理方法根據質譜儀種類不同分為兩類。第1類是用于LC-MS/MS的血液標本，可以分為血清和干燥濾紙血斑兩種。用于血?；鈮A和氨基酸分析的標本處理方法如下：采集相當于3.2 μL全血的3 mm直徑濾紙血斑或血清，加入含氨基酸和?；鈮A同位素內標的甲醇，提取血中的氨基酸和?；鈮A，然后用衍生法或非衍生法處理，最后進樣分析。衍生法或非衍生法均可采用商業化試劑，常用的有美國CIL公司(Cambridge Isotope Laboratories Inc.)的NSK-A and NSK-B同位素內標和美國PerkinElmer公司的NeoBase 試劑盒，前者需要自備儀器分析使用的流動相溶酶，而后者試劑盒中提供了儀器分析使用的流動相溶酶。衍生法和非衍生法的選擇主要取決于所用質譜儀的敏感性。衍生法可以提高微量成分的檢出敏感性。但是對于目前由各大廠商提供的最新型號的質譜儀來說，用非衍生法處理的標本的檢測靈敏度已經達到衍生法的要求，既可以簡化標本前處理流程又可以節約試劑成本。但對于一些型號比較陳舊的質譜儀，必須用衍生法處理標本。第2類是用于GC/MS的尿液標本，可以分為原尿和干燥濾紙尿兩種。用于尿液中代謝成分譜的標本處理方法主要有有機溶媒提取法和尿素酶處理法。有機溶酶提取法的主要原理是在酸化條件下用雙乙基醋酸反復3次提取，獲取尿液中含有羧基的有機酸成分，然后經氣化衍生進行質譜分析。尿素酶處理法的主要原理是在尿液中加入尿素酶，分解尿中大量存在的尿素，然后對所有含有羧基、氨基、羥基的代謝成分進行氣化衍生并進行質譜分析。有機溶酶提取法僅能進行有機酸成分分析，其結果用于有機酸血癥的診斷。尿素酶處理法不僅可分析有機酸，還可對氨基酸、糖、核酸類成分進行分析，其結果可用于更廣泛的代謝病的分析診斷。兩種尿液標本前處理方法的比較見表1。

3. 質譜儀的選擇目前，用于代謝疾病篩查的主要儀器型號及其生產廠商見表2。各儀器廠商都配有一定程度的代謝病篩查分析軟件。LC-MS/MS和GC/MS儀器的選擇主要是圍繞代謝疾病篩查分析的配套軟件和儀器性能維護服務。

表1　有機溶媒提取法和尿素酶處理法的比較

表2　質譜儀的選擇

注：數據截止至2013年

4. 儀器分析方法的設定(1)LC-MS/MS：LC-MS/MS的儀器設定基本比較統一，各實驗室間的差異主要在于測定成分的種類，如氨基酸中難度較大的堿性氨基酸的測定(對各種堿性氨基酸如賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、瓜氨酸、組氨酸等的精確檢測有利于多種氨基酸代謝異常的鑒別診斷)，還有就是對?；鈮A中長鏈?；鈮A的檢出敏感性和穩定性問題(含20碳以上的?；鈮A的準確檢測有利于長鏈或極長鏈脂肪酸代謝異常疾病的鑒別診斷)；(2)GC/MS：不同的實驗室在GC升溫條件和毛細層析柱方面均有各自的側重和差異。不同的層析柱種類和升溫條件會導致部分檢測成分出現差異。質譜分析的檢出模式建議采用電子沖擊離子化全掃，這樣會獲得更全面的代謝譜信息。

5. 數據判讀解讀質譜分析得到的數據非常關鍵。由于大部分人體代謝產物沒有標準品可供參照，儀器本身配套的通用質譜庫也不能滿足全部體液成分的定性分析，所以通過辨認質譜圖中每個檢出波峰，對所有檢出成分進行定性是一個繁瑣和專業的過程，這相當于把非常抽象的物理學數據翻譯成醫學專業用語。這個過程需要由經過專業培訓、具備專業知識的技術人員來完成，其判讀結果是后期疾病診斷的重要參考資料。

6. 結果分析數據判讀得到的結果反映了人體代謝的代謝譜狀態。這個狀態是正常還是異常的判斷歸結于結果分析，其分析基準包括代謝譜的分布是否處于正常狀態、應該檢出的成分指標是否在正常范圍內、不應該檢出的成分是否被檢出、各成分之間的比例平衡是否被打亂、出現代謝不平衡時不平衡出處在哪里，在人體代謝圖譜中位點定位如何等，由此推測出代謝疾病的可能代謝障礙環節。結果分析是代謝紊亂原因探索的關鍵，直接影響疾病的臨床診斷。因此建議由掌握正常人體代謝、熟知代謝成分的生物化學意義和代謝圖譜中各種代謝途徑的醫學生化學專業人員來完成。

7. 報告制作和發送根據數據判讀、結果分析得到的資料做出本次質譜分析的檢查報告。遺傳代謝病在臨床上屬于罕見病、疑難病，臨床醫生碰到的機會稀少，對待這類疾病的臨床經驗淺薄，所以代謝病分析報告需要提示代謝分析的異常點在哪里、造成異常的原因有哪些、可以提示的遺傳代謝病是哪種、這種代謝病的臨床特點有哪些、如何最終診斷這種代謝疾病、如何治療和追蹤隨訪這種代謝病，由此完善和實現遺傳代謝病質譜分析的實際意義。因此，遺傳代謝病檢驗報告的制作建議由有遺傳代謝病專業背景的醫學專家來參與完成。

8. 質控管理(包括室間質評、室內質控及國內、國際質控)上述標本采集、處理、檢測、結果分析、報告形成的一系列過程需要按照嚴格的標準化操作流程來實施。與其他檢驗科項目相同，質譜分析結果質量的評估最終要歸結為質控管理，但質譜分析目前還沒有很標準的質控管理程序。各家實驗室均采用自家標準監測每次實驗情況，通過對儀器的強檢最大限度的排除儀器設備帶來的實驗誤差。在室間質評方面，中國衛生部臨床檢驗中心2013年開展了全國新生兒遺傳代謝病串聯質譜篩查-氨基酸(血斑)和酰基肉堿(血斑)室間質控評價活動。這項室間質評活動剛實施了2年，數據還有待于積累和改善。在國際上，美國疾病預防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)的室間質評管理體系面向全世界，開展的評估活動有相對較長的歷史，積累了很多的經驗，但采用的質控標本多為人為制作的標本，對實際患者的檢測評估方面稍有不盡意之處。近10余年來比較權威的代謝病室間質評管理機構為歐洲遺傳代謝病篩查評改和診治研究網絡(European research network for evaluation and improvement of screening, diagnosis and treatment of inherited disorders of metabolism，ERNDIM)。該機構是由世界權威代謝病專家組成的監督組織，積累了大量代謝病患者的標本資料，采用實際已確診的患者標本進行質控管理評估。目前已有上百家代謝病專業實驗室參加由其組織的室間質評活動。日本MILS已有10年的參加經驗。ERNDIM的管理體系近年也在不斷完善，其使用的室間質評標本來源于患者，結果評估非?？陀^、實際，值得推薦。在此也建議實驗室室內質控也盡可能選用患者標本，因為患者標本最客觀，能反映儀器檢測質量，保證準確、高效的檢驗服務。

四、遺傳代謝病質譜分析實驗室的國際化

遺傳代謝病的實驗室檢測是一個非常復雜且要求技術和人員配置非常高端的檢驗項目，臨床醫生對實驗室結果的依存度高，實驗室檢測中各個環節產生差異都將直接影響臨床醫生的資料參照、臨床診斷、治療及預后。為了能提供高質量的代謝病質譜分析檢驗結果，作者最近10年創立了國際代謝病網絡實驗室體系，其示意圖見圖1。

圖1國際化代謝病質譜分析網絡實驗室體系示意圖

國際代謝病網絡實驗室體系的核心是對實驗室配置、標本處理方法及儀器分析方法進行固化，儀器分析后的數據集中到數據分析中心。數據分析中心擁有數據解讀、結果分析、報告制作和合成的熟練的專業技術人員，可以隨時對接收到的數據進行分析并做出最完善的結果報告返回給數據來源實驗室，最后通過當地實驗室完成末端臨床檢驗服務。計劃開展代謝病質譜分析的醫療機構可以申請加入該體系，獲得該醫療機構的代謝病實驗室編號和配有網絡實驗室配置的全套實施辦法、細則以及實驗室標準操作流程文件，按要求完善實驗室配置和標本處理分析后，把分析數據通過固定網絡端口傳送至網絡實驗室數據分析中心。數據分析中心會在規定時間內返回分析報告，然后實驗室將返回的分析報告轉送給臨床醫生。這個體系的優點是質譜分析實驗室本身不需要進行長期的技術人員培訓，也不需要配備數據解讀和結果分析的專業技術人員，但隨時可以獲得國際代謝病質譜分析技術服務，是新開展遺傳代謝病篩查的實驗室的檢測質量快速與國際接軌的絕好的捷徑。經過近10年的發展，國際代謝病網絡實驗室體系中已積累了大量世界各國代謝病患者的資料，對各地區人群代謝病發病譜的分析也有了很大的資源、資料可循。該體系的數據分析中心由來自世界各國的代謝病分析研究專家參與，可提供世界各國的代謝病臨床咨詢服務。

五、結論

本文圍繞遺傳代謝病的質譜分析發展的歷史、目前質譜分析在代謝病分析診斷方面的現狀以及遺傳代謝病篩查實驗室的管理辦法做了闡述。同時介紹了高效現代化的代謝病分析實驗室國際網絡體系的操作模式，希望能對大家在組建和管理代謝病篩查實驗室方面有所借鑒。

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(本文編輯：龔曉霖)

收稿日期：(2014-12-21)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0410-06R446.1

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.002

作者簡介：張春花，女，1963年生，博士，研究員，主要從事遺傳代謝病研究。