茶皂苷的超聲波提取及抗真菌作用研究

夏曉萍俸春紅葉 紅鄭彩虹劉龍孝

（1.浙江大學藥學院；2.浙江大學醫學院附屬婦產科醫院；3.中國農業科學院茶葉研究所）

茶皂苷是來源于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物茶（Camellia sinensis L.）的果實（茶籽）中的一類三萜皂苷。根據研究表明，茶籽中的皂苷是實現其藥理作用的主要成分。茶皂苷屬五環三萜皂苷，由苷元、糖體和有機酸三部分組成，糖體連接在3位碳的取代基上。苷元系齊墩果烷型，由苷元母核及取代基組成。基本結構如圖1。

圖1 茶皂苷的苷元母核結構

茶皂苷提取法主要是水提法和有機溶劑法，本文在傳統的有機溶劑提取法基礎上，應用超聲提取工藝，采用L9(34)正交試驗設計考察提取溶劑乙醇濃度、液料比、溫度和超聲時間對茶皂苷提取得率的影響，優選出最佳提取方案。以高效液相色譜法測定茶皂苷含量。近年來，茶皂苷藥理作用成為研究的熱點，有學者報道茶皂苷有抗菌作用，民間也有將茶籽餅粕用于治療皮膚病的經驗方。本文考察茶皂苷對臨床常見的致病性真菌（念珠菌）的體外抗菌活性。

一、材料與方法

1.儀器與材料

（1）實驗材料

茶籽系2014年11月采摘自浙江杭州龍井種(Camellia sinensis cv.Longjing)的成熟果實。茶皂苷對照品：中國農業科學院茶葉研究所提供(茶皂苷純度≥95%)。RPMI—1640培養基(含L-谷酰胺而不含碳酸氫鈉，含pH指示劑)（上海生工生物）；科瑪嘉顯色培養基（鄭州博賽生物技術有限公司）；沙保培養基（SHAB-101101）(法國生物梅里埃)；嗎啉基丙磺酸（MOPS）（上海生工生物）。甲醇（色譜純，PROLABO）其余試劑均為分析純。

（2）試驗菌株

念珠菌30株：包括標準質控菌株6株：其中白色念珠菌4株（ATCC64548,ATCC90029,ATCC64550,ATCC10231）；近平滑念珠菌 1株（ATCC22019）；克柔念珠菌 1株（ATCC6258）。臨床分離株24株：其中白色念珠菌（Candida albicans）12株；光滑念珠菌(Candida glabrata)6株；克柔念珠菌(Candida krusei)3株；近平滑念珠菌(Candida krusei)3株。（標準菌種由中國藥品生物制品鑒定所提供、臨床分離株由浙江大學醫學院附屬婦產科醫院臨床分離)。

（3）試驗設備與儀器

Agilent HP1100型高效液相色譜儀；超聲波清洗機（USC-702，江蘇昆山超聲儀器有限公司）；水浴恒溫振蕩器（DSH2-300，江蘇太倉試驗設備廠）；冷凍干燥機（VIRTIS）；生物安全柜（The Baker Company）；全自動微生物分析儀(VITEK-Compact,法國生物梅里埃)；漩渦混合器（VORTEX-GENIE2）；生化培養箱 (上海精宏實驗設備有限公司)

2.試驗方法

（1）茶皂苷的提取

茶籽脫殼、干燥、粉碎至40目篩，得淺黃色茶籽粉末。乙醚脫脂，干燥得脫脂茶籽粉。取一定量的脫脂茶籽粉按特定比例的料液比，加入乙醇溶液，超聲提取；超聲功率300W，超聲頻率40KHZ。過濾，濾液減壓回收溶劑，冷凍干燥，得茶皂苷提取物。

（2）超聲輔助提取茶皂苷的單因素試驗、正交試驗及驗證試驗

以80%乙醇、料液比1∶10，超聲提取時間20min,提取溫度30℃，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ的提取參數為基礎，以茶皂苷提取得率為考察指標，依次進行乙醇濃度、料液比、提取時間、溫度的單因素試驗，分析各因素對提取得率的影響，進行正交試驗，并對正交試驗最優組合進行驗證。

（3）茶皂苷檢測方法

高效液相色譜法檢測。

a.標準曲線的制作

精密稱取0.1g茶皂苷對照品，置于100mL容量瓶，加適量流動相，超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。色譜柱：Agilent Zrobax SB-C18柱（4.6mm×150mm,5μm）；流動相：甲醇-水（88：12）；流速：0.8mL/min；檢測波長：280nm；柱溫：25℃；進樣量：10μ L。分別精密移取對照品樣儲備液適量，用流動相稀釋成濃度20μg/mL,40μg/mL,80μg/mL,160μg/mL，320μg/mL,640μg/mL系列濃度，記錄色譜峰面積。茶皂苷是由多種三萜類物質組成的混合物，對照品的濃度與峰響應值成線性，以對照品濃度X（μg/ml）對應的峰面積Y制定標準曲線，外標法定量測定茶皂苷含量。

b.茶皂苷測定

精密稱取茶皂苷提取物0.1g，置于100mL容量瓶用流動相溶解，移取5mL，稀釋至50mL即得供試液。供試液過0.45μm濾膜后進樣。每個樣品平行制備3份供試品。在上述的色譜條件下，測定峰面積，計算茶皂苷含量。

c.茶皂苷提取得率計算

茶皂苷提取得率（%）=茶皂苷質量／脫脂茶籽粉質量×100%。

（4）抗真菌作用研究

采用美國國家臨床實驗室標準化委員會（CLSI）制定的酵母菌（M—27A）方案測定抗念珠菌活性。

a.試藥稀釋

先配制高濃度貯存液。實驗時，再以RPMI液體培養基稀釋成終濃度的2倍。其終濃度分別為1269.76μg/mL，634.88μg/mL，317.44μg/mL，158.72μg/mL， 79.36μg/mL，39.68μg/mL，19.84μg/mL，9.92μg/mL，4.96μg/mL。

b.試驗培養基

按CLSI方案的要求采用RPMI—1640培養基。稱取RPMI—1640粉10.4g，MOPS34.53g，加入去離子水900mL，用1M NaOH調pH7.0(25℃),定容至1L。MOPS終濃度為：0.165mol/L,0.22μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存備用。

c.菌懸液制備

念珠菌在沙保培養基上連續轉種2次，以確保純度和活力。經28℃培養48h,取5個直徑大于1mm的菌落于5mL無菌生理鹽水中震蕩15s，制成菌懸液。用血細胞計數板將其濃度調至菌濃度為1～5×106CFU/mL。然后用RPMI液基1∶50稀釋后再1∶20稀釋，（即共稀釋1000倍），至菌濃度1～5×103CFU/mL。

d.接種、培養

取微孔96孔板，1～9列孔中由高濃度至低濃度分別加0.1mL藥液，再加0.1mL菌懸液。11號孔加0.2mL菌懸液（陽性孔）,12號孔加0.2mL空白對照。（不加藥物的液基）。

藥敏板用塑料包裹后，念珠菌35℃培養48h。觀察結果。

e.結果判讀

按照CLSI制定的標準進行結果判讀。最小抑菌濃度(MIC)為肉眼直接觀察到的真菌生長的完全被抑制時的藥物濃度。在一批實驗中，所有被測菌株得到的MIC值為MIC范圍；能抑制50%或80%受試菌所需的MIC值，分別為MIC50值和MIC80值。

二、結果與分析

1.標準曲線的制定和精密度試驗

按色譜條件對照樣系列溶液進樣分析,分別以對照樣系列溶液的峰面積為縱坐標,以對照品樣系列溶液的質量濃度X（μg/mL）,繪成標準曲線對峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程：X=0.239Y-14.336，r=0.9998。結果表明在濃度20～640μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

精密度試驗：取160μg/mL的對照品溶液，連續進樣6次，記錄保留時間和峰面積，RSD（n=6）分別為1.97%和1.73%。

重現性試驗：取制備的茶皂苷提取物，共6份，平行制備供試液，進樣體積10μL，記錄色譜峰面積，RSD為2.95%（n=6）

2.單因素對茶皂苷提取得率的影響

(1)溫度對茶皂苷提取得率的影響

分別選擇30℃、40℃、50℃、60℃和70℃ 5個溫度,以80%乙醇為提取溶劑，料液比1∶10，超聲時間20min，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ為參數。考察溫度對茶皂苷提取得率的影響。圖2A顯示：溫度升高有利于茶皂苷的提取，但當溫度升至70℃的提取得率與溫度60℃的相比，無統計學差異，且溫度過高，易引起茶皂苷結構的變化。因此，選擇40℃、50℃、60℃作為正交試驗因素水平。

(2)乙醇濃度對茶皂苷提取得率的影響

分別選擇50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液5個濃度提取溶劑，以料液比1∶10，超聲時間20min，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ為參數，考察不同濃度的乙醇提取溶劑，對茶皂苷提取得率的影響。圖2B顯示：隨著提取溶劑含水量增加，茶皂苷提取得率增加。80%乙醇的茶皂苷提取得率顯著高于90%乙醇（P＜0.01）；70%乙醇茶皂苷提取得率高于80%的乙醇提取得率（P＜0.05）；但60%乙醇和70%乙醇的茶皂苷提取得率無統計學差異。且當乙醇濃度為60%時，茶皂苷提取得率較高但雜質增加。故選擇70%、80%、90%乙醇作為正交試驗的因素水平。

(3)超聲時間對茶皂苷提取得率的影響

提取時間分別選擇 10 min、20 min、30 min、40 min、50min，以80%乙醇為提取劑，料液比1∶10，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ為參數。考察超聲時間對茶皂苷提取得率的影響。圖2C顯示：初始，隨著超聲時間增加，茶皂苷提取得率隨之增加，但時間超過30min，得率不增加。因此：選擇20min、30min、40min為正交試驗因素水平。

(4)料液比對茶皂苷提取得率的影響

分別選擇1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30料液比，以80%乙醇作為提取溶劑，超聲時間20min，超聲功率300W，超聲頻率40KHZ為參數。考察不同料液比，對茶皂苷提取得率的影響。圖2D顯示：隨著料液比提高，茶皂苷提取得率并沒有相應增加。因此選擇1∶10、1∶15、1∶20為正交試驗因素水平。

3.正交試驗

為了全面考察茶皂苷提取得率的影響因素，根據單因素試驗結果，選取4因素3水平，即L9（34）正交表進行正交試驗。試驗因素見表1，L9（34）正交試驗見表2，每個水平重復試驗3次。通過極差比較和F檢驗法對正交試驗結果進行方差分析，結果見表3。

圖2 單因素對茶皂苷得率的影響

表2中的R值顯示：4種因素對茶皂苷提取得率的影響程度依次為B＞A＞C＞D，其中B因素的影響遠大于其他3種因素。超聲提取茶皂苷的最佳方案：B1D2C3D3，即70%乙醇濃度，料液比1∶15，超聲時間40分鐘，提取溫度60℃。

表3的F檢驗結果顯示：乙醇濃度（B因素）、液料比（D因素）、超聲時間（C因素）、提取溫度（A因素）均對茶皂苷提取得率具有顯著的影響。

表1 茶皂苷提取的正交試驗設計因素及水平設置

表2 茶皂苷提取的L9（34）正交試驗設計及結果

表3 茶皂苷提取的正交試驗的方差分析

4.超聲輔助提取茶皂苷最佳工藝檢驗結果

按優選的最佳工藝條件，提取茶皂苷并重復試驗3次。結果為提取得率：18.06%，RSD：2.78%。提取得率大于正交試驗中的組合。

5.茶皂苷體外抗真菌活性

微孔藥敏板35℃培養48h。將每孔生長情況與陽性孔和空白對照孔相比較，可見陽性孔念珠菌生長良好，空白對照孔無念珠菌生長。茶皂苷對念珠菌體外抗菌活性見表4。結果顯示：茶皂苷體外抗念珠菌活性顯著。

表4 茶皂苷抗念珠菌活性 （μg/mL）

三、討論

1.超聲提取技術是利用超聲波輻射產生的空化效應、機械振動、乳化作用、擴散作用等增加物質分子運動的頻率和速度，增大溶劑的穿透力，加速目標成分進入溶劑，快速、高效提取細胞內容物。與傳統的萃取提取技術比較，能顯著地提高提取效率。本試驗得到了較優的提取工藝參數：70%乙醇濃度，料液比1∶15，超聲時間 40min，提取溫度60℃，提取得率達18.06%；溶劑用量（料液比）顯示并不與提取得率成正比。

2.念珠菌（假絲酵母菌）是引起真菌病中最常見的機會致病性真菌。念珠菌可引起淺部真菌感染，也會引起深部真菌感染。白色念珠菌在念珠菌屬中最為常見，致病性最強。基于環境、氣候因素，尤其是臨床廣譜抗生素、皮質類固醇、免疫抑制劑等的廣泛使用，導致念珠菌感染臨床高發。臨床上現有的抗真菌藥物如唑類抗真菌藥、兩性霉素B等在高效低毒、耐藥性方面的評價不能令人滿意。本試驗研究結果顯示：茶皂苷有較好的體外抗念珠菌活性，其中對光滑念珠菌的抗菌活性最強MIC80僅79.36μg/mL，白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌克的柔念珠菌MIC80值317.44μg/mL，茶皂素是山茶屬植物重要活性成分，茶皂苷抗真菌活性顯著，其藥理活性值得進一步研究。