姜黃素對大腦中動脈缺血模型大鼠的神經保護作用及機制研究

李姝雅，王伊龍，王春雪，劉改芬，王擁軍

腦缺血后局部炎性因子的表達顯著增加，且急性炎性因子的升高程度與臨床預后緊密相關[1]。Notch信號通路調控神經干細胞的浸潤分化和血管新生[2-4]，并參與炎癥反應過程[5]。研究發現，Notch 1可與經典炎性因子NF-κB共活化參與炎癥反應的調控。姜黃素（curcumin），黃色粉末，為姜黃根莖的生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗血管粥樣硬化及保護肝腎等多種生物學作用[6-7]。本研究擬通過公認的線栓法建立穩定的大鼠大腦中動脈梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，通過觀察姜黃素對Notch 1和NF-κB的作用，進一步探討其神經保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試劑

成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠93只，體重250～280 g，清潔級，由河北醫科大學基礎醫學院動物實驗中心提供。姜黃素（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）：用含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS配制，濃度12.5 mg/ml。

1.2 試驗動物分組與給藥

1.2.1 姜黃素對Notch 1和NF-κB表達的影響 試驗動物分為三組（63只）：①姜黃素組（CUR）：參照Longa線栓法制作大鼠右側MCAO模型。在MCAO模型基礎上按80 mg/kg劑量腹腔注射配制好的姜黃素溶液。②溶劑對照組（vehicle-control）：在MCAO模型基礎上按80 mg/kg劑量腹腔注射含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS。③假手術組（sham）：除不在頸內動脈插入線栓外，其余步驟同Longa線栓法操作，模型制作完成后按80 mg/kg劑量腹腔注射含0.5 mol/L NaOH的0.01 PBS。每組均按時間點分為對照、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h共7個亞組，每個亞組3只大鼠。用免疫組化和Western blot的方法測定Notch 1和NF-κB的動態表達。

1.2.2 姜黃素急性腦缺血的神經保護作用 30只大鼠隨機分配至CUR組、vehicle-control組、sham組，建模48 h評價神經功能學評分，5只用于腦含水量測定，5只用于梗死體積測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 神經功能學評分 Longa改良評分法：0分：沒有神經功能缺損；1分：左側（癱瘓側）前爪不能完全伸展；2分：左側（癱瘓側）前肢不能伸展；3分：行走時，大鼠向左側（癱瘓側）轉大圈；4分：行走時，大鼠向左側（癱瘓側）轉小圈；5分：行走時，大鼠身體向左側（癱瘓側）傾倒[8]。

1.3.2 腦含水量的測定 將成功入組的大鼠在相應時間點麻醉后斷頭處死，取出完整腦組織，前去額極，后去部分枕葉，留取腦組織中間部分厚約4 mm。將腦組織放入事先稱重的錫箔紙中包好稱重，減去錫箔紙重量即得濕重。將包有錫箔紙的腦組織放入95℃烤箱內烘干24 h，取出待測腦組織恢復到室溫，反復稱量至恒重，減去錫箔紙重量即得干重。腦組織含水量：（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.3 腦梗死體積百分比測定 大鼠麻醉斷頭處死后，取出完整新鮮腦組織，連續切成2 mm厚的冠狀組織切片，置于新鮮配制的2%的2，3，5-三苯基四唑氮紅（triphenyltetrazolium chloride，TTC）中，37℃孵育30 min。用Olympus SP560數碼相機采取圖像，Image Pro-Plus 5.1分析系統對圖片進行分析。總梗死體積=總梗死面積×腦片的厚度。水腫修正后梗死體積=對側半球體積-（損傷側半球體積-損傷側半球梗死體積）。梗死體積百分比（%）=修正后梗死體積/對側半球體積。

1.3.4 免疫組織化學法檢測Notch 1和NF-κB陽性細胞 按照SP試劑盒說明書（北京中杉生物工程有限公司）進行免疫組織化學染色。所用Notch 1兔抗大鼠多克隆抗體（1∶400，Abcam Biotechnology），NF-κB P65兔抗大鼠多克隆抗體（1∶150，Santa Cruz Biotechnology）。光鏡下胞質中棕黃色顆粒為陽性產物。

1.3.5 Western blot法檢測Notch 1和NF-κB蛋白按照總蛋白提取試劑盒說明書（北京普利萊公司）提取蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒（美國Novagen）測定蛋白濃度。取等質量的樣本蛋白（30 μg），進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（初始電壓80 V 1 h，后100 V 1 h）；將標本蛋白轉移至PDVF膜上；TBST洗滌3次，每次5 min；加入TBST稀釋的一抗（兔抗大鼠Notch 1抗體，1∶300，Abcam Biotechnology，兔抗大鼠NF-κB P65抗體，1∶100，Santa Cruz Biotechnology），4℃搖床過夜。TBST洗滌3次，每次10 min；封閉2 h后加入熒光標記的二抗工作液（1∶6000，Rockland），室溫下避光振蕩1 h。TBST洗滌3次，每次10 min；圖像掃描分析。

1.4 統計分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素下調了Notch 1和NF-κB在MCAO中的表達

與vehicle-control組相比，CUR組中Notch 1和NF-κB表達下調，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見表1、圖1和圖2。

2.2 姜黃素降低神經功能評分

與vehicle-control組相比，CUR組降低MCAO后48 h時神經功能評分，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見圖3。

2.3 姜黃素減輕腦水腫

用干濕重法測得的腦組織含水量結果顯示：sham組為（78.16±8.00）%，vehicle-control組為（83.71±7.00）%，CUR組的腦組織含水量較vehicle-control組有所下降，為（80.42±9.00）%，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見圖4A。

2.4 姜黃素減少梗死體積

腦梗死體積測定結果顯示，CUR組為（28.94±6.20）%，低于vehiclecontrol組的（40.08±3.66）%，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見圖4B。

3 討論

表1 免疫組織化學陽性細胞數的動態表達

圖1 免疫組織化學陽性細胞數的動態表達

姜黃素是從姜科姜黃屬植物的根莖中提取的一種植物多酚，是姜黃發揮藥理作用最重要的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護肝腎功能等多種生物學功能。在宮頸癌的研究中發現，姜黃素可通過降低Notch和NF-κB的表達起到抗癌作用，說明姜黃素與Notch通路間存在聯系[9-10]。姜黃素用于治療缺血性腦血管病，可減少腦水腫和梗死面積，改善神經功能學評分，其作用機制尚未明確。研究證實，姜黃素能升高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，降低腦缺血病灶周圍的氧化應激反應，挽救缺血半暗帶的神經元，減輕缺血后腦損傷。炎癥反應在缺血后腦損傷機制中的作用已得到共識，NF-κB作為炎癥反應的核心因子，在缺血性腦損傷中起到重要作用。姜黃素通過抑制NF-κB的表達，干擾下游基因的轉錄發揮抗炎作用。對于姜黃素的抗炎作用是否可作為其腦保護作用機制之一，本實驗結果提示，姜黃素可同步降低缺血后腦組織中NF-κB和Notch 1的表達，推測Notch信號通路可能通過調節NF-κB的表達參與姜黃素的腦保護作用。

圖2 不同時間點測定Western blot蛋白表達水平

圖3 不同組別神經功能學評分

圖4 姜黃素對腦含水量及梗死體積的影響

1 Lopes LR，Zekavati A，Syrris P，et al. Genetic complexity in hypertrophic cardiomyopathy revealed by high-throughput sequencing[J]. J Med Genet，2013，50：228-239.

2 Oya S，Yoshikawa G，Takai K，et al. Attenuation of Notch signaling promotes the differentiation of neural progenitors into neurons in the hippocampal CA1 region after ischimic injury[J]. Neuroscience，2009，158：683-692.

3 Chen J，Zacharek A，Li A，et al. Atorvastatin promotes presenilin-1 expression and Notch 1 activity and increases neural progenitor cell proliferation after stroke[J]. Stroke，2008，39：220-226.

4 Hellstr?m M，Phng LK，Hofmann JJ，et al. Dll4 signalling through Notch 1 regulates formation of tip cells during angiogenesis[J]. Nature，2007，455：776-780.

5 Arumugam TV，Chan SL，Jo DG，et al. Gamma secretase-mediated Notch signaling worsens brain damage and functional outcome in ischemic stroke[J].Nat Med，2006，12：621-623.

6 Chan WH，Wu HJ. Protective effects of curcumin on methylglyoxal-induced oxidative DNA damage and cell injury in human mononuclear cells[J]. Acta Pharmacol Sin，2006，27：1192-1198.

7 Tong QS，Zheng LD，Lu P，et al. Apoptosis-inducing effects of curcumin derivatives in human baldder cancer cells[J]. Anticancer Drugs，2006，17：279-287.

8 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J]. Stroke，1989，20：84-91.

9 Hackler L Jr，ózsvári B，Gyuris M，et al. The curcumin analog C-150，influencing NF-κB，UPR and Akt/Notch pathways has potent anticancer activity in vitro and in vivo[J]. PLoS One，2016，11：e0149832.

10 Liu S，Cao Y，Qu M，et al. Curcumin protects against stroke and increases levels of Notch intracellular domain[J]. Neurol Res，2016，38:553-559.