缺血性卒中不同亞型的血漿標志物研究進展

王源，潘旭東

缺血性卒中是卒中最常見的形式，按照急性卒中治療低分子肝素試驗病因分型法（The Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分為大動脈粥樣硬化型卒中（large artery atherosclerotic，LAA），小動脈閉塞型卒中（small artery occlusion，SAO），心源性栓塞（cardioembolism，CE），其他原因的急性卒中（stroke of other determined etiology，SOE）和原因未明的卒中（stroke of undetermined etiology，SUE）[1]。卒中的發病原因復雜，亞型的重要價值在于區分不同發病原因，提出不同的治療方案，提高治療效果和預后。目前較為公認的LAA型卒中主要由動脈粥樣硬化繼發動脈閉塞或狹窄導致的，SAO型卒中主要由小動脈的玻璃樣變、脂質變性和小動脈硬化導致，CE型卒中由心源性栓子導致。

近年不斷有新的分型提出，針對TOAST分型的不足做改進，但病因亞型的核心沒有改變，并且這些新的分型仍有不足。在現階段，TOAST病因分型仍為最重要的分型。

缺血性卒中的診斷主要依靠顱腦計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振做出。要做好亞型分類首先需要腦血管的顯像檢查，包括磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、CT血管造影（CT angiography，CTA）、數字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）、顱腦超聲，還需要做心臟超聲等。但在臨床實踐中發現，即使腦血管顯像檢查和心臟檢查完善，仍有部分患者無法做出準確亞型分類，比如大動脈粥樣硬化和小動脈閉塞并存，確定此次發病的亞型困難，對治療方案制訂造成影響；合并存在心房顫動和大動脈狹窄應被列入病因未明亞型，對治療和預后判斷也造成困難。此外，由于兩種亞型的病因并存情況較多，造成病因未明亞型比例過高，對治療和預后造成不利影響，需要新的技術手段對亞型給予區分。近年來，有些技術正在引起關注，其中卒中相關血漿標志物的檢測日益增多，為反映不同亞型的病因和發病機制、探討患者的預后，從而進一步指導臨床治療及二級預防提供了新的依據，下面將該領域的進展做一綜述。

1 LAA型卒中的相關血漿標志物

LAA型卒中是缺血性卒中最常見的類型，約占全部腦梗死的60%，是在各種原因的基礎上，腦動脈主干或分支動脈管腔狹窄超過50%、閉塞，引起腦局部血流減少或中斷，使腦組織缺血、缺氧性壞死，出現局灶性神經系統癥狀和體征[1]。目前認為動脈粥樣硬化為此型腦梗死的基本原因，與動脈粥樣硬化相關的血漿標志物有以下幾種。

1.1 微小核糖核酸 微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類由21～25個核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA，主要通過與靶mRNA 3’非翻譯區（3’untranslated region，3’UTR）不完全互補配對的方式在轉錄后水平負向調控靶mRNA表達，最終導致mRNA降解或翻譯抑制[2]。

已有研究證實，miRNAs能以穩定的形式存在于人體血漿中[3]。既往研究顯示，miRNAs在血管內皮細胞炎癥和衰老，血管平滑肌細胞增生，血管完整性維持及膽固醇代謝等過程中發揮調控作用，并且在神經元損傷及缺血性卒中發病過程中也起到重要調控作用[4-8]。

Hergenreider等[9]研究顯示，miR-143在正常動脈的平滑肌細胞中高表達，在血管受損后表達下調，對患有動脈粥樣硬化的小鼠注射miR-143微泡，能減少小鼠體內動脈粥樣硬化病變的形成。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）能夠介導內皮細胞的凋亡進而參與血管慢性炎癥反應，靶基因預測結果顯示TNF-α是miRNA-23a的靶基因之一，Ruan等[10]研究表明miR-23a通過caspase-7的絲氨酸/蘇氨酸激酶4-caspase-3的途徑調節TNF-α介導的內皮細胞凋亡。動脈粥樣硬化是動脈壁對血管內皮細胞損傷的一種慢性炎癥過程，血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）介導內皮細胞損傷后的黏附過程，生物學功能分析顯示VCAM-1是miR-126的潛在靶點之一。因此miRNA-126可能通過調節VCAM-1的表達參與血管炎癥的形成，Long等[11]的研究表明，miRNA-126可作為缺血性卒中潛在的標志物。

本課題組采用高通量測序技術對人類血漿miRNAs表達譜也進行了研究，研究結果表明，LAA型卒中患者及SAO型卒中患者血漿miRNAs表達譜存在明顯差異，提示miRNAs可能通過靶基因在LAA及SAO的發病過程中發揮不同的調節作用[12-13]。此外本課題組對存在差異表達的部分miRNAs進行了實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證及生物信息學分析，研究表明，血漿中miRNA-146b和miRNA-23a水平在LAA型腦梗死組顯著降低且與病情的嚴重程度呈負相關，提示二者可作為LAA型腦梗死的急性期血漿標志物，并有助于判斷病情的嚴重程度[14]；miR-143、miR-126與腦動脈粥樣硬化的廣泛程度相關，且受腦梗死影響較小，可考慮作為腦動脈粥樣硬化的血漿標志物[15]。

目前，miRNA與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的相關研究尚處于初期階段，兩者的關系有待于進一步闡明，這可能會成為新的研究領域，為LAA型卒中的診療帶來益處。

1.2 骨保護素 骨保護素（osteoprotegerin，OPG）是1997年Tsuda等在人胚胎肺纖維細胞中發現的一種分泌蛋白，是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族的一員，具有調節骨密度的作用。在隨后的更多研究中，OPG與心血管疾病的關系越來越被重視，它可保護血管內皮細胞、抑制血管鈣化和動脈粥樣硬化，在動脈粥樣硬化的發生發展中起著重要的調節作用。

到目前為止，已有許多關于OPG和動脈粥樣硬化的研究，OPG對動脈粥樣硬化介導作用的機制正在慢慢被揭開。Golledge等[16]的研究發現，細胞間黏附分子隨著OPG與腫瘤壞死因子的濃度增加而增加，單核細胞結合在這些黏附分子上，隨著它們進入血管內膜，這是動脈發生粥樣硬化的關鍵步驟之一。斑塊內炎性細胞及其炎性產物可能是造成斑塊不穩定、斑塊破裂的促發因素。巨噬細胞是構成不穩定斑塊的主要細胞。不穩定斑塊處OPG水平升高，T淋巴細胞表達核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）增多，單核細胞分泌RANK增多。Sandberg等[17]對100例胸痛患者進行血漿OPG分析，發現與穩定型心絞痛患者及正常對照組相比，不穩定型心絞痛患者的血清OPG水平明顯升高。該研究同時發現，在經過冠狀動脈介入治療（這是一種醫源性斑塊破裂）的患者，外周血單核細胞可表達更多的RANKL。RANKL可促使單核巨噬細胞聚集與浸潤，并由此使粥樣斑塊中平滑肌骨化，可增加不穩定型心絞痛患者基質金屬蛋白酶在血管平滑肌中的活性，使細胞浸潤、粥樣斑塊生長。OPG可通過競爭RANK與RANKL結合，從而抑制基質金屬蛋白酶在血管平滑肌中的活性。同時OPG和RANKL結合可抑制血清RANKL的清除，穩定RANKL水平。這個研究還發現了蛋白酶似乎在動脈粥樣硬化斑塊基質降解中起了關鍵作用，使其容易破裂。

本課題組采用酶聯免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）測定血漿OPG、sRANKL水平，比較三組間血漿OPG、sRANKL水平；同時為評價LAA組患者腦動脈粥樣硬化廣泛程度，將LAA組分為單支、雙支、多支病變3個亞組，評價OPG、sRANKL、OPG/sRANKL比值與AS廣泛程度的相關性。對LAA組患者隨訪3個月，結合mRS評分，應用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估OPG、sRANKL、OPG/sRANKL比值對預后的預測價值。研究結果表明血漿OPG、sRANKL水平與LAA型卒中的發病、AS病變廣泛程度及預后有關；可作為評價LAA型卒中的發病及AS病變廣泛程度的血漿標志物；尤其是OPG/sRANKL比值有助于評估AS廣泛程度和判斷預后[18]。

1.3 S-100B蛋白 S-100蛋白是一種酸性鈣結合蛋白，相對分子質量21 000 Da，主要存在于中樞神經系統各部位的星狀神經膠質細胞的細胞液中，因其在飽和硫酸銨中能夠100%溶解而得名。S-100蛋白由α和β兩種亞基組成3種不同的形式，即S-100αα、S-100ββ、S-100αβ，其中S-100ββ、S-100αβ統稱為S-100B蛋白。S-100B蛋白主要存在于神經膠質細胞和神經膜細胞中。星形膠質細胞作為大腦中最豐富的膠質細胞，其末梢參與組成完整的血腦屏障，當中樞神經系統細胞損傷時，缺血區星形膠質細胞通過凋亡和壞死兩種方式死亡，S-100B蛋白從細胞液中釋放，并且血腦屏障的破壞在早期再灌注時，可使原來存在于局部缺血梗死核心區的大量S-100B蛋白釋放入血液，因此，外周血中S-100B蛋白作為一種特異性腦源性蛋白，是中樞神經系統損傷的特異和敏感的生物標志物。較早的研究均發現，急性缺血性卒中（acute cerebral ischemic stroke，AIS）時S-100B蛋白水平顯著增高，對AIS的診斷和預后有重要意義[19]。近期的研究結果也顯示，S-100B蛋白參與的生物標志物組合，早期診斷AIS顯示出較高的敏感度和特異性[20]。但Dassan等[21]也指出，雖然S-100B蛋白主要存在于中樞神經系統，但因黑色素瘤、肌上皮細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等也可表達S-100B蛋白，在缺血性卒中時不能排除神經系統以外的因素使S-100B蛋白升高的可能性，其得出的結論是：應用S-100B蛋白早期診斷缺血性卒中特異性低，在卒中急性期S-100B蛋白并沒有迅速出現明顯升高，在癥狀出現24 h后開始升高，峰值出現在第3天。臨床上尚無健康人群的外周血或腦脊液S-100B蛋白正常值的統一標準，這也造成了各項試驗中對S-100B蛋白的評估標準不統一。對于S-100B蛋白的應用價值，有待進一步深入研究。

1.4 妊娠相關血漿蛋白A 妊娠相關血漿蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）是一種鋅離子結合的金屬蛋白酶，由不穩定性斑塊中的各種活化細胞產生并釋放到細胞外基質中。PAPP-A在腐蝕和破裂的冠狀動脈及頸動脈斑塊纖維帽肩部的單核-巨噬細胞中大量表達，而在穩定性斑塊中極少表達。PAPP-A還是一種特異的胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）激動劑，使活化的IGF-1結合到細胞表面1型IGF受體，IGF-1能誘導細胞增殖、分化和遷移，激活炎癥細胞，促進斑塊的發展和去穩定性。Sangiorgi等[22]提出PAPP-A是頸動脈斑塊去穩定性和破裂的一個標志物，并且有可能成為腦血管事件危險分層的一個新靶點。既往研究中，穩定性斑塊組與不穩定性斑塊組、穩定性斑塊組與不穩定性破裂斑塊組之間、不穩定性斑塊未破裂組與不穩定性破裂斑塊組之間血清PAPP-A水平差異均具有顯著性，而穩定性斑塊組與不穩定性斑塊未破裂組之間差異無顯著性，血清PAPP-A水平與斑塊易損程度呈正相關關系[23]。表明PAPP-A可能與頸動脈斑塊的去穩定和破裂相關，特別是與破裂關系可能更加密切。

1.5 基質金屬蛋白酶 基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組Zn2+、Ca2+依賴性蛋白酶，其主要功能是降解和重構細胞外基質。迄今為止，已發現20多種MMPs家族成員，按其分子結構及底物的不同可分為明膠酶（MMP-2、MMP-9），膠原酶（MMP-1、MMP-8），基質溶解酶（MMP-3、MMP-7、MMP-10），膜型基質蛋白酶和其他不能分類的基質酶5類。正常狀態下，MMPs被控制在較低水平，但在一些病理條件下，其活性顯著增加，參與組織的損傷與修復。在缺血的早期，內皮細胞屏障即受損，導致水分子和其他小分子物質滲出，此時，基膜層的屏障作用也被破壞，而MMPs系統是參與細胞外基質降解和重構的重要因子，尤其是MMP-9含有纖維蛋白結合區域，可以特異性攻擊層蛋白、纖連蛋白等，與細胞外基質的降解關系最為密切。既往國內外的許多臨床研究也證實，AIS患者血清MMP-9水平在超早期即出現顯著升高，因此可應用于早期輔助診斷AIS[24]。Ramos等[25]對22項相關研究、3289例AIS患者進行回顧性研究分析，指出與對照組相比，MMP-9在缺血性卒中急性期即出現顯著升高，并與梗死范圍、梗死嚴重程度及預后損傷程度顯著相關。各項相關研究結果均提示，MMP-9作為輔助診斷AIS的生物標志物具有很大的臨床應用潛力。

1.6 可溶性CD40配基 CD40和CD40L（CDl54）均為腫瘤壞死因子超家族成員，由參與AS形成的主要細胞共同產生，兩者之間的相互作用增加了各種促AS因子的表達，如各種黏附分子、化學因子、細胞因子、生長因子和MMP。Zirlik等[26]用低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體缺陷小鼠證實，CD40是粥樣斑塊發展的重要信號，阻斷CD40能抑制AS病變的進展；當斑塊破裂誘導血小板活化時，則會導致斑塊表面CD40L表達增加，從而介導血管壁內炎癥級聯反應，激活內皮細胞，促進血液凝固，最終導致急性腦缺血事件的發生和發展。Hocher等[27]的研究表明，與對照組相比，急性缺血性卒中患者血小板表面sCD40和單核細胞表面CD40表達顯著增加，說明兩者可能參與了易損斑塊的形成和血栓形成事件的發生。

2 SAO型卒中的相關血漿標志物

SAO型卒中是指大腦半球或腦干深部的小穿通動脈，在長期高血壓的基礎上，血管壁發生病變，導致管腔閉塞，形成小的梗死灶。目前認為病因主要與高血壓引起的腦部小動脈玻璃樣變、動脈硬化性病變及纖維素樣壞死等有關。

2.1 miRNA SAO型卒中發病的病因主要與高血壓引起的腦部小動脈玻璃樣變、動脈硬化性病變及纖維素樣壞死等有關。近年來，已有研究表明高血壓發病的機制受到miRNAs目的基因的調控，眾所周知，腎素-血管緊張素-醛固酮系統在血壓升高過程中起到重要作用。已有研究表明血管緊張素Ⅱ 1型受體（angiotensinⅡ type 1 receptor，AT1R）和miR-155在內皮細胞和血管平滑肌細胞共同表達，miR-155可在翻譯水平抑制AT1R表達[28]。另外，用轉化生長因子-β1處理原代培養的人肺成纖維細胞能使miR-155表達下調，而TNF-α僅和干擾素-β可誘導巨噬細胞表達miR-155，造成炎癥過程中性粒細胞/單核細胞增多。因此，miR-155可能是炎性介質的靶點和調節淋巴細胞和骨髓細胞功能的靶點。業已證實，缺血性腦損傷后，腦組織和血液中miR-155表達水平均顯著下調[29]。

本課題組通過高通量測序在LAA型及SAO型腦梗死的差異表達的miRNAs進行了進一步熒光定量PCR驗證及生物學功能分析，結果表明，miRNA-451a在SAO型患者血漿中表達顯著下調，miR-320a、miR-99b、miR-127在SAO型患者血漿中表達顯著上調，提示miRNA-451a、miR-320a、miR-99b、miR-127可作為SAO型腦梗死的急性期血漿標志物[14]。

2.2 α2巨球蛋白 α2巨球蛋白（α2-macroglobulin，α2-MG）是一種蛋白酶抑制物，通過中和血纖維蛋白溶解酶、纖溶酶原激活物和金屬蛋白酶促進凝血。此外，α2-MG被認為是白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的載體蛋白而參與炎癥反應。已有研究表明α2-MG在急性卒中患者的血漿中含量高于正常人，并且差異具有顯著性，提示α2-MG可能作為急性腦血管疾病的生物標志物[30]。此外，該研究認為α2-MG水平與腦白質病變有關，可能反映出慢性腦小血管疾病的病理生理過程。

本課題組應用酶聯免疫吸附測定法對LAA型卒中、SAO型卒中及健康對照患者血漿α2-MG濃度進行了測定。研究結果表明α2-MG水平可考慮作為診斷SAO的血漿標志物，是SAO的獨立危險因素，且與腦部白質損害程度密切相關[31]。

2.3 細胞間黏附分子-1 細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）又叫作CD54，屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成員，是介導黏附反應重要的一個黏附分子。ICAM-1在靜息的血管內皮細胞上呈低水平表達，通過與血管內皮細胞表面上的特異性受體結合而發揮其生物學活性。作為白細胞和內皮細胞跨膜的蛋白質，ICAM1在穩定細胞間相互作用和促進白細胞和內皮細胞的遷移起到重要作用。ICAM-1的受體有淋巴細胞功能相關抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）和Mac-1，均屬于整合素家族。LFA-1是ICAM-1的主要受體，而Mac-1與ICAM-1的親和力較低，纖維蛋白原也可成為ICAM-1的配體之一。ICAM-1（G1548A）基因多態性研究表明ICAM-1表達增加為急性卒中的一個獨立的危險因素[32]。

3 CE型卒中的相關血漿標志物

心源性腦栓塞占腦栓塞發病的60%～75%，是由于心內膜或心瓣膜產生的栓子脫落到達腦血管，造成動脈堵塞致病。其中，心房顫動為心源性栓塞最常見的原因，心房顫動時左房收縮性降低，血流緩慢淤滯，易導致附壁血栓，栓子脫落形成腦栓塞。

3.1 可溶性晚期糖基化終產物受體 晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）屬于細胞表面分子免疫球蛋白超家族中的一個成員，可與多種配體結合后影響細胞內信號轉導、刺激細胞因子釋放等從而發揮其生物學效應，與動脈粥樣硬化及炎癥等密切相關。胞外區的RAGE稱可溶性晚期糖基化終產物受體（soluble receptor for advanced glycation endproducts，sRAGE），可阻斷配體與RAGE結合，抑制RAGE的作用。

Montaner等[33]的研究顯示，與動脈粥樣硬化血栓形成及腔隙性梗死相比，心源性腦栓塞患者的sRAGE水平較高，提示sRAGE水平可為腦梗死亞型的判斷提供診斷依據。Park等[34]的研究顯示，非心源性卒中患者sRAGE水平較低，認為低sRAGE水平是動脈粥樣硬化過程的潛在生物學標志物。

本課題組采用酶聯免疫吸附測定法檢測CE患者37例，LAA患者36例，以及無癥狀大動脈狹窄患者43例，健康對照組48例血漿中sRAGE的濃度，并比較各組sRAGE水平的差異，研究結果表明sRAGE濃度增高是CE的獨立危險因素；log sRAGE=3.5197 pg/ml可作為鑒別CE與LAA的最佳臨界值；且sRAGE水平增高可考慮用于判斷CE的復發（待發表）。

3.2 D二聚體與腦鈉肽 已有研究對707例缺血性卒中患者進行血液生物標志物檢測，結果顯示腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）及D二聚體（D-Dimer）等在心源性栓塞卒中亞型患者中高表達且對CE預測如下：當BNP＞76 pg/ml及D-dimer＞0.96 μg/ml時，OR值（odds ratios）分別為2.3與2.2[35]。

綜上所述，血漿標志物可以幫助臨床醫生對缺血性腦血管病進行準確的病因分型，為進一步指導治療及二級預防提供了新的依據。要找到缺血性卒中不同亞型的血漿標志物，需具備特異性強、敏感度高且利于TOAST亞型區分等特點。但目前上述標志物仍需進一步研究與驗證。

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