慢性阻塞性肺疾病患者外周血T淋巴細胞凋亡檢測的臨床價值

慢性阻塞性肺疾病患者外周血T淋巴細胞凋亡檢測的臨床價值

廖長征，徐文莉，陳思祖

(深圳市龍崗中心醫院中心實驗室，廣東 深圳 518116)

摘要：目的探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血CD4`+、CD8`+ T細胞凋亡水平與肺功能的相關性。方法采用流式細胞術測定30例COPD緩解期患者、30例COPD急性期患者及20名健康體檢者外周血CD4`+和CD8`+ T細胞凋亡水平，與第1秒用力呼出量占預計值百分比(FEV1%)和FEV1/用力肺活量(FVC)水平作相關分析。結果COPD患者CD4`+ T細胞凋亡水平較健康對照組明顯升高(P<0.01)，其中急性期顯著高于緩解期(P<0.05)；COPD患者CD8`+T細胞凋亡水平明顯低于健康對照組(P<0.01)，其中急性期明顯低于緩解期(P<0.05)。CD4`+ T細胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC呈負相關(P<0.01)；CD8`+ T細胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC呈正相關(P<0.01)。結論CD4`+ 、CD8`+ T細胞凋亡水平與肺功能具有密切相關性，其水平變化可作為監測COPD患者病情的重要指標。

關鍵詞：細胞凋亡；T淋巴細胞亞群；肺功能；慢性阻塞性肺疾病

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)10-0971-04R446.63

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.001

Abstract:ObjectiveTo investigate the correlation of the apoptosis of peripheral blood CD4`+ and CD8`+ T cells with lung function in chronic obstructive pulmonary disease (COPD)patients. MethodsA total of 30 stable COPD patients, 30 acute exacerbation COPD patients and 20 healthy subjects were enrolled. The apoptosis of peripheral blood CD4`+ and CD8`+ T cells was determined by flow cytometry. The correlation of T lymphocyte apoptosis with forced expiratory volume 1 second (FEV1%) and FEV1/forced vital capacity (FVC) was analyzed. ResultsThe CD4`+ T cell apoptosis of COPD group increased significantly with that of healthy control group(P<0.01), and that of acute exacerbation group was higher than that of stable group (P<0.05). The CD8`+ T cell apoptosis of COPD group was lower than that of healthy control group (P<0.01) . The CD8`+ T cell apoptosis of acute exacerbation group was lower than that of stable group(P<0.05). CD4`+ T cell apoptosis was negatively correlated with FEV1% and FEV1/FVC, and CD8`+ T cell apoptosis was positively correlated with FEV1% and FEV1/FVC (P<0.01). ConclusionsThe apoptosis of CD4`+ and CD8`+ T cells is closely related to lung function in COPD patients, which can be used as an indicator for the monitor of COPD.

作者簡介：廖長征，男，1971年生，副主任技師，主要從事醫學檢驗工作。

收稿日期：(2014-12-04)

Clinical significance of peripheral blood T lymphocyte apoptosis determination for chronic obstructive pulmonary disease patientsLIAOChangzheng,XUWenli,CHENSizu.(CentralLoboratory,ShenzhenLonggangCentralHospital,GuangdongShenzhen518116,China)

Key words: Cell apoptosis；T lymphocyte subset；Lung function；Chronic obstructive pulmonary disease

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)居全球死亡病因第4位，目前其發病率和死亡率仍在逐漸增加，由于其患者數量多，死亡率高，社會經濟負擔重，已成為一個重要的公共衛生問題[1]。目前COPD的發病機制尚未完全明了，針對病理組織的研究認為，炎癥導致COPD患者氣管壁的損傷與修復過程反復發生，進而使氣管結構重塑及瘢痕形成，導致肺組織受損，肺功能下降[2]。有文獻證實，細胞凋亡在COPD的發生、發展過程中起了重要作用[3-4]。作為在COPD發病中占重要地位的炎性細胞——T淋巴細胞的凋亡情況與肺功能的關系研究較少，本研究通過對COPD患者外周血T淋巴細胞亞群凋亡水平及肺功能的測定，分析兩者間的相關性，以期了解其在COPD發病中的意義，為臨床治療提供實驗依據。

材料和方法

一、材料

1.研究對象選擇深圳市龍崗中心醫院2013年1至12月呼吸科門診及住院就診的COPD患者60例，納入標準符合我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2013年修訂版)[5]。排除支氣管哮喘、肺結核、支氣管擴張、肺間質纖維化、肺癌及肺部手術等病史；排除心、腦、腎及免疫系統疾病，且近期內未使用糖皮質激素類藥物。其中緩解期患者30例(COPD緩解期組1)，男17例，女13例，年齡(63±10)歲；急性發作期患者30例，男21例，女9例，年齡(62±9)歲，給予常規抗炎、平喘化痰治療，癥狀明顯緩解出院后，電話隨訪復診，其中20例符合入選標準，作為自身比較的緩解期組(COPD緩解期組2)。由于吸煙會影響呼吸功能[6-7]，健康對照組選擇在深圳市龍崗中心醫院行健康體檢結果無異常的非吸煙健康人群，共20名，男12名，女8名，年齡(59±10)歲。組間年齡、性別差異均無統計學意義(P<0.05)。

2.儀器和試劑hypAir型肺功能儀(比利時Medisoft公司)，CH20BIMF2000光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，FACS Calibar型流式細胞儀(美國BD公司)。7-氨基放線菌素D(7-amino-actinomycin D, 7-AAD)、鈣依賴性磷脂結合蛋白(Annexin V)-異硫氰基熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、抗CD4藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、抗CD8-PE、Binding Buffer以及淋巴細胞分離液等均為美國BD公司產品。

二、方法

1.肺功能的測定受試者吸入400 μg沙丁胺醇后，采用Medi-soft肺功能儀按照操作標準測定患者第1秒用力呼出量占預計值百分比(forced expiratory volume 1 second，FEV1%)和FEV1/用力肺活量(forced vital capacity，FVC)。

2.流式細胞術測定T淋巴細胞亞群凋亡 受試者晨起抽取靜脈血4 mL(肝素抗凝)，樣本處理步驟按照說明書進行操作以提取淋巴細胞，并將細胞濃度調整到105～106/mL間。分別取細胞懸液100 μL與CD4-PE 10 μL 或CD8-PE 10 μL、7-ADD 5 μL 以及Annexin V-FITC 5 μL均勻混合充分，置于室溫(20～25 ℃)避光15 min，加400 μL 1×Binding Buffer在1 h內上機檢測。

三、統計學方法

結果

一、CD4 +和CD8 +T細胞凋亡率以及FEV1%、FEV1/FVC測定值水平間的比較

4組間CD4+、CD8+T細胞凋亡水平及FEV1%、FEV1/FVC測定值水平存在明顯差異，其中COPD急性期組CD4+T細胞凋亡水平最高，COPD緩解期組1和COPD緩解期組2差異無統計學意義(P<0.05)，總體COPD緩解期組次之，健康對照組最低；COPD急性期組CD8+T細胞凋亡水平及FEV1%、FEV1/FVC測定值最低，COPD緩解期組1和COPD緩解期組2差異無統計學意義(P<0.05)，總體COPD緩解期組次之，健康對照組最高。見表1、圖1和圖2。

表1　COPD組與健康對照組T淋巴細胞亞群凋亡率及肺功能指標的比較

注：a圖為健康對照組；b圖為COPD緩解期組1；c圖為COPD急性期組；d圖為COPD緩解期組2 圖1　CD4 + T細胞凋亡率流式細胞術檢測散點圖

注：a圖為健康對照組；b圖為COPD緩解期組1；c圖為COPD急性期組；d圖為COPD緩解期組2 圖2　CD8 + T細胞凋亡率流式細胞術檢測散點圖

二、CD4 +和CD8 + T細胞凋亡與FEV1%、FEV1/FVC之間的相關性

CD4+T細胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC呈負相關，CD8+T細胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC呈正相關。見表2。

表2　CD4 +、CD8 + T細胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC之間的相關性

討論

COPD是一種具有氣流受限不完全可逆呈進行性發展的慢性呼吸系統疾病[8]，其病因極其復雜，與遺傳、環境以及遺傳與環境的交互作用相關，近年來細胞凋亡的研究日益受到重視，并有COPD的發生、發展與細胞凋亡相關的報道[3-4,9]。

機體作為一個整體維持正常免疫功能狀態，有賴于各種免疫細胞特別是各類T細胞亞群之間的相互協調和制約，產生適度性免疫應答。T淋巴細胞是細胞免疫的效應細胞和免疫調節細胞，其中輔助性CD4+T淋巴細胞和抑制性CD8+T淋巴細胞對機體免疫系統發揮重要的細胞和體液免疫調節作用，機體正常免疫功能需要T淋巴細胞亞群保持相對的穩定性，尤其CD4+/CD8+比值的穩定，國內外文獻研究發現，T淋巴細胞亞群表達異常在COPD發病中起著重要作用[10-12]。本實驗結果顯示，COPD患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞凋亡失衡，造成了COPD患者T淋巴細胞亞群表達異常，因此在COPD免疫治療中也要注重細胞凋亡的調節。

肺功能檢查是判斷氣流受限的主要客觀指標，FEV1%是中、重度氣流受限的良好指標[13]，已有研究證明FEV1%、FEV1/FVC能穩定地顯示COPD各分期肺功能水平[14]，本研究使用二者代表肺功能，經Pearson相關分析發現CD4+、CD8+T細胞凋亡水平與FEV1%、FEV1/FVC存在較強的負相關關系，CD8+T細胞凋亡水平與FEV1%、FEV1/FVC存在較強的正相關關系，這說明隨著CD4+T細胞凋亡水平的升高和CD8+T細胞凋亡水平的降低，肺功能逐漸下降。本研究結果顯示，COPD患者緩解期CD4+T細胞凋亡水平明顯高于健康對照組，急性期又高于緩解期，加之CD4+T細胞死亡增多，二者共同引起CD4+T細胞下降，從而影響表面帶有IgA的B淋巴細胞向分泌IgA的漿細胞轉化，導致機體免疫功能低下從而引發反復的呼吸道感染，感染使呼吸衰竭過早發生[15-16]。本研究結果還顯示，COPD患者緩解期CD8+T細胞凋亡水平明顯低于健康對照組，急性期又低于緩解期，即說明CD8+T細胞存在凋亡延遲。有研究顯示，凋亡延遲使CD8+T細胞存活時間延長，從而表達高水平的穿孔素和增強的細胞毒活性[17]，引發肺組織的損傷，導致肺功能的下降，這與本實驗結果一致。

綜上所述，CD4+、CD8+T細胞凋亡水平與肺功能間具有較高的相關性，其濃度水平的檢測有望成為COPD病情診斷及療效判斷的有效指標。

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(本文編輯：姜敏)