人胚胎三叉神經節細胞發育形態學測量

人胚胎三叉神經節細胞發育形態學測量

廖禮彬1, 姚雪萍2, 吐爾遜江·達地汗3, 古麗尼沙·克力木3

(新疆醫科大學基礎醫學院1組織胚胎學教研室,2機能實驗中心,3人體解剖學教研室， 烏魯木齊830011)

摘要:目的觀察人胚胎三叉神經節細胞隨胎齡增長的變化發育規律。方法取19～32 w人胚胎三叉神經節,光鏡觀察,進行細胞計數，圖像分析儀測量三叉神經節細胞面積、周長、直徑。結果隨著胎齡增長三叉神經節細胞數目無明顯變化，直徑隨胎齡增長而增大，面積和周長均隨胎齡增大而明顯增大。結論人胚胎三叉神經節細胞形態發育在7～8個月(32 w)時達成年人水平；但細胞數目隨胎齡增長無明顯變化。

關鍵詞:三叉神經節細胞; 測量; 人胚胎

中圖分類號：R322.8文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.013

[收稿日期：2014-07-14]

The Morphometry on development of trigeminal ganglion cells in human embryo

LIAO Libin1, YAO Xueping2, Tuerxunjiang Dadihan3, Gulnisa Kerem3

(3TheHistologyandEmbryologyDepartmentofPreclinicalCollege,2TheMechanismLab

CenterDepartment,3TheHumanAnatomyDepartment，

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the development of human embryonic trigeminal ganglion cells with fetal development. MethodEmbryonic trigeminal ganglion aged from 19 to 32 weeks were observed by light microscopy; the cells were counted, and image analysis instrument was used to measure the area, perimeter and diameter of trigeminal ganglion cells. ResultsWith the development of fetus, the number of trigeminal ganglion cells showed no significant changes, but they grew in diameter while the area and perimeter of cells increased significantly. ConclusionThe morphology development of trigeminal ganglion cells in human embryo achieved adults′ level at 7-8 months (32 weeks), but the number of cells showed no significant change with the development of fetus.

Key words: trigeminal ganglion cells; measurement; human embryo

神經系統是人體各系統中發育較早的一個系統，人胚胎第3周在脊索的誘導下神經外胚層形成神經板，再由神經板分化為神經元。關于神經元的發生過程做過大量研究，如不同動物的脊神經的計數及胞體大小測量等；也有研究報道三叉神經節方面的形態研究主要是在形態結構及定位方面[1-3]。國外學者觀察了貓三叉神經節內不同神經細胞的結構特征，并分別對豚鼠、兔、貓、猴和人的三叉神經節進行了比較觀察[4-6]。但三叉神經節發育尤其人胚胎三叉神發育方面的資料較少,Wu等[7]對小鼠三叉神經節細胞生后發育進行觀察，但這些觀察都沒有進行詳細的定量研究, 也未見有關人胚胎三叉神經節發育方面的報道。因此,本研究除從三叉神經節細胞形態方面進行觀察外, 著重觀察人胚胎三叉神經節細胞隨胎齡增長的變化發育規律。

1材料和方法

1.1實驗材料從新疆醫科大學第二附屬醫院醫院收集非疾致死的流產胎兒共7例，男性3例，女性4例，胎齡19～40 w，通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審核，標本提供者已簽署知情同意書。

1.2實驗方法和步驟

1.2.1標本固定在獲取標本后4 h內，手術刀片切開胸腔，充分暴露心臟，小心切開心包腔，找到升主動脈根部，連續向根部推注生理鹽水300～500 mL行心臟沖洗，再注入10%福爾馬林1 000 mL，用眼科剪在右心房處剪一小切口，讓固定液沿體循環途徑行灌流固定，當頭部和四肢變硬飽滿后，即固定好。將標本保存在新鮮配置的10%福爾馬林溶液中進行后固定，干燥處避光保存。

可分兩個層次進行，首先要建立健全水行政執法信息統計系統，全面掌握我國水事違法案基本情況，為“兩法銜接”機制建設提供技術支撐。建議國務院水行政主管部門加快建立國家層級的水行政執法信息統計系統，各流域管理機構、省（自治區、直轄市）建立本區域范圍的執法信息統計系統，實現水利系統內部水行政執法信息共享，同時為刑事司法機關查閱相關信息提供便利。其次，按照國家 “行政執法與刑事司法銜接信息共享平臺”的要求，將“水行政執法統計信息”納入共享平臺中，實現各級水行政執法機關、公安機關和檢察機關的相互監督制約，及時發現涉嫌水事違法犯罪線索，加大打擊犯罪力度。

1.2.2組織切片待完全固定后，取胎頭并PBS漂洗干凈，沿胎頭耳廓上方1 cm處環形去掉頭皮、顱蓋骨，暴露端腦，摘取雙側大腦半球及間腦。在外科顯微鏡下去掉部分中腦后，確定左側三叉神經根、三叉神經節及三大分支眼神經、上頜神經、下頜神經的位置，分別在眶上裂處切斷眼神經，在圓孔處切斷上頜神經，在卵圓孔處切斷下頜神經，在腦橋基底部切斷三叉神經根，小心完整剝離左側三叉神經根、節分支，修整組織后，置于新鮮配置的10%福爾馬林溶液中。梯度酒精脫水，石蠟包埋，全程連續冠狀切片，片厚4 μm，HE染色后中性樹膠將切片標本封固，每張切片標記排序。

1.3細胞計數與測量

1.3.1細胞計數單位以可見清晰核仁的神經細胞為計數單位，在HE染色片上三叉神經節細胞核與細胞質對比明顯，與周圍衛星細胞和成纖維細胞易區分，胞體輪廓界限清晰，減少了細胞漏計或重計的概率。

1.3.2三叉神經節細胞計數計數三叉神經細胞時，每個胎齡組隔3張取1張完整的切片。光鏡下(×400)利用Motic images Advanced 3.2 圖像處理分析軟件沿三叉神經半月節弧形方向進行測量，計算出每個視野中神經節細胞的數目，同時記錄每個神經節所觀察視野的總數，測量每個視野的面積，求出每個視野體積=視野的面積×切片厚度；最后計算出1個視野體積中三叉神經節細胞平均密度=所有視野神經節細胞的數目總和/觀察視野的總數，按公式N=V/vD 粗略計算出神經節細胞數目(N：神經節細胞數；V：神經節體積；v：1個視野體積；D：1個視野體積中的神經細胞平均密度)。將N代入Abercrombie[8]的校正公式，得出實際應有的神經細胞數目。

1.3.3三叉神經節細胞直徑、面積與周長的測量每個胎齡組隔3張取1張完整的切片，每張切片按“S”形取樣法，每張切片計數20個視野；光鏡下(×400)利用 Motic images Advanced 3.2 圖像處理分析軟件，選擇軟件菜單中“線段”選項，調試好“物鏡”、“單位”和“精度”；通過核仁測量神經細胞胞體最長直徑為長徑，經核仁垂直長徑者為短徑；選擇軟件菜單中“多邊形”選項，其他選項與直徑測量相同；沿細胞外側緣做多邊形曲線勾勒出細胞的整個輪廓，形成一個閉合的邊緣；閉合邊緣內部分即細胞的面積。周長測量方法同面積。

1.4統計學處理采用SPSS17.0 統計軟件包對數據進行處理，細胞計數采用相關分析，其余測量所得數據以均數±標準差(±s)表示，對各胎齡段細胞直徑、周長及面積進行單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1三叉神經節細胞的光鏡觀察鏡下可見神經節細胞散在分布在神經纖維之間，團塊狀或者成群分布；細胞界限清晰,胞體卵圓形或圓形，大小不等，胞質在19～25 w胎齡期嗜酸性，呈粉紅色(圖1a、b)。27 w時胞質呈淡藍紫色，尼氏顆粒漸明顯(圖1c)。32 w后，細胞核為1個，居中，近似圓形，其內染色質顆粒較少，呈空泡狀，核仁明顯，基本居中，呈紫紅色(圖1d)。各胎齡組細胞大小隨胎齡增長而增大。

a: 19 w三叉神經節細胞形態

b: 25 w三叉神經節細胞形態

c: 27 w三叉神經節細胞形態

d: 32 w三叉神經節細胞形態

圖1不同胎齡三叉神經節細胞光鏡圖(HE×400)

表1　不同胎齡組人胚胎三叉神經節神經細胞數目/個( ±s)

表1　不同胎齡組人胚胎三叉神經節神經細胞數目/個( ±s)

胎齡/w左側右側兩側平均1923841±11624071±10823956±1122024769±20424317±31424543±2592525078±16923981±20924529±1892724785±11825134±15224959±1353225420±32125943±28725681±304

表2　不同胎齡組人胚胎三叉神經節細胞直徑比較( ±s)

表2　不同胎齡組人胚胎三叉神經節細胞直徑比較( ±s)

胎齡/w例數直徑/μm長徑短徑面積/μm2周長/μm19199.73±19.7169.66±13.144702.96±500.92233.54±32.7820199.53±10.2271.34±19.184610.24±301.02232.08±17.26251113.13±25.0778.84±10.245919.33±423.09267.34±136.18272216.37±26.43*Δ▲177.76±26.54*Δ▲30707.21±9848.54*Δ▲623.88±146.11*Δ▲322261.78±31.39*Δ▲200.46±39.12*Δ▲42166.42±9186.59*Δ▲721.05±295.43*Δ▲

注：與19 w比較,*P<0.05; 與20 w比較,ΔP<0.05; 與25 w比較,▲P<0.05。

3討論

神經元是機體所有細胞中最令人感興趣和與眾不同的特殊細胞。除了嗅神經元、海馬的齒狀回及少數特異腦區的神經元外，哺乳動物在胚胎發育的高峰期之后不再出現增殖和分裂。腦脊神經節內神經元的胞體主要成群地聚于神經節的周緣部分, 少量也散布在神經節中央神經纖維之間。每個神經元胞體有衛星細胞形成的囊包繞, 胞體發出的單個突起穿出衛星細胞囊, 再分叉為中央支和周圍支, 構成神經節中的神經纖維束。

從20世紀開始就有學者對不同動物各種腦脊神經節細胞數目與直徑進行觀察和研究，從種類上看，對于同一種動物單個腦神經節比單個脊神經節的神經細胞數目要多,大白鼠三叉神經節細胞數目明顯比頸、胸等脊神經數目要多[9-10]。從神經節分類看，則高級動物的同一種神經節的細胞數目較多, 如兔的三叉神經節數目為72 452個，而小鼠僅為13 864～15 212個[11-13]，提示動物越高級，神經系統就越發達，神經節數目越多。另外有可能與神經分布區的大小有關。

本研究主要系統地通過光鏡觀察和分析軟件對利用人類胚胎三叉神經節細胞大小、數量進行測量，從多角度、多途徑、全方位對三叉神經節細胞發育進行研究。結果發現19～32 w胎齡胎兒兩側神經元數目并無明顯差別，且隨胎齡增長神經細胞數目變化不明顯。與其他動物神經節比較，人三叉神經節細胞數目應該比兔、貓等個體較大動物多，但結果相反。可能因為所研究的動物都是成年的，而本研究采用的是胚胎期的標本，處于發育過程中。在此過程中，最初生成的神經元的數目遠比以后存留的數目多，未能與靶細胞建立連接的神經元在一定時間內死亡，神經細胞數目決定于神經上皮細胞的分裂增殖及成神經細胞的遷移和死亡；其數目一般經歷一個由少到多、由多到少的變化過程；開始神經元細胞的增加是由于上皮細胞的分裂增殖和成神經細胞的遷入所致；之后的減少是由于沒有能建立正常聯系的神經細胞死亡的結果[14]。這些變化主要發生在胚胎時期。本研究觀察的是胚胎期神經細胞，但未發現此規律。本研究過程中細胞數目或許正在經歷一個緩慢的由少到多的變化期，處在一個相對的穩定期，還未經歷到迅速增長期。

Puri等[15]報道同一物種同一神經節(小鼠腰神經節)存在差別，這很可能與研究者運用了不同的測量方法有關；但最突出一個特點是同一神經節神經元胞體的大小有一較大變化范圍,說明其胞體大小不一致。本研究也發現了相似的現象，人胚胎三叉神經節細胞直徑大小在90～230 μm范圍內變化。分析其原因有2個：(1)因為胚胎發育過程整個細胞胞體都在逐漸增加，本研究對象是一個動態連續的胎齡組，隨胎齡增大，直徑、面積及周長逐漸增大，在發育至25 w時出現一個迅速增長期。(2)對同一個神經節來說，細胞胞體的大小本身就有大、小之分。

總之,本研究發現三叉神經節細胞直徑隨胎齡增長而增大，面積和周長隨胎齡增長而明顯增大，尤其以25～32 w增長明顯，說明此時期為三叉神經節細胞發育的一關鍵時期，但細胞數目無明顯變化。

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(本文編輯楊晨晨)