新疆維吾爾族、漢族結直腸癌患者中KRAS及BRAF基因突變差異及其與預后的關系研究

新疆維吾爾族、漢族結直腸癌患者中KRAS及BRAF基因突變差異及其與預后的關系研究

孫毅1, 艾力江·吐爾遜1, 楊娜2，古麗比也·沙比爾1, 趙化榮1, 王文然1, 劉攀1,

肖蕾1, 瑪依努爾·艾力1, 包永星1

(1新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心， 烏魯木齊830054;2新疆維吾爾自治區人民醫院放療一科， 烏魯木齊830001)

摘要:目的探討新疆維吾爾族(維族)、漢族結直腸癌伴肝轉移患者中KRAS基因及BRAF基因突變差異及其與臨床病理特征和預后的關系。方法選擇新疆醫科大學第一附屬醫院2005年1月-2010年12月收治的100例新疆維、漢族結直腸癌伴肝轉移患者,應用PCR及Pyrosequencing測序法檢測分析KRAS基因及BRAF基因突變情況，分析其與臨床病理特征和預后的關系。結果維、漢族結直腸癌伴肝轉移患者的KRAS與BRAF基因突變率分別為28%(28/100)與5%(5/100)。50例漢族患者中KRAS基因突變18例, BRAF 基因突變2例；50例維吾爾族患者中KRAS基因突變10例，BRAF基因突變3例。原發腫瘤組織學分級、區域淋巴結轉移、脈管瘤栓、肝外侵犯或轉移、KRAS和BRAF為結直腸癌的預后影響因素(P<0.05)；多因素分析顯示，脈管瘤栓(P=0.035)、KRAS基因(P=0.001)為結直腸癌的獨立的預后因素。結論在新疆維、漢族結直腸癌伴肝轉移患者中，脈管瘤栓及KRAS基因具有主要的預后價值。積極檢測KRAS基因，可望延長患者生存期。

關鍵詞:KRAS； BRAF; 新疆； 維吾爾族； 漢族； 結直腸癌； 同時性肝轉移； 預后

中圖分類號：R657.1文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.011

[收稿日期:2014-01-14]

Prognostic in role of KRAS and BRAF in colorectal cancer cases with

synchronous liver metastases in the Uyghur and Han nationality in Xinjiang

SUN Yi1，Ailijiang Tuerxun1，YANG Na2，Gulibiye Shabier1，ZHAO Huarong1，WANG Wenran1，

LIU Pan1，XIAO Lei1，Mayinuer Aili1，BAO Yongxing1

(1DepartmentofOncologyCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China;2TheXinjiangUygurAutonomousRegionPeople′sHospitaloftheFirst

Departmentofradiotherapy,Urumqi830001,China)

Abstract：ObjectiveTo analyse the relations among clinical pathological characteristics, prognosis and gene mutation of KRAS and BRAF with whom carry Colorectal Cancer Cases and Synchronous Liver Metastases in the uyghur and han nationality in Xinjiang. MethodsThe clinical and pathological data of Colorectal Cancer Cases with Synchronous Liver Metastases in the Uyghur and han nationality in Xinjiang treated at Xinjiang MedicaI University from January 2005 to December 2010 were retrospectively reviewed and analyzed，including KRAS and BRAF. ResultsKRAS and BRAF tumor mutation rates were 28.0% and 5.0%, respectively. Of 50 cases Han nationality ,18 cases KRAS and 2 cases BRAF were gene multation, of the uyghur, 10 cases KRAF and 3 cases BRAF. Univariate analysis with Kaplan-Meier methods revealed that the differentiation of the primary tumor, N status， lymphatic and vascular invasion， extrahepatic disease, KRAS and BRAF were prognostic factors (P<0.05)． Multivariate analysis showed that lymphatic and vascular invasion (P=0.035)， KRAS (P=0.001) were independent prognostic factors of colorectal cancer patients with synchronous liver metastases． ConclusionThe lymphatic and vascular invasion and KRAS have significant prognostic value for colorectal cancer with synchronous Iiver metastases． It is necessary to detect KRAS gene for Colorectal Cancer Cases with Synchronous Liver Metastases in the uyghur and han nationality in Xinjiang.

Key words: KRAS gene and BRAF gene; Colorectal Cancer in the Uyghur and han nationality in Xinjiang; Synchronous liver;Prognosis

結直腸癌(colorectal cancer)是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，發病率居惡性腫瘤的第3位[1]，我國結直腸癌發病率呈逐年上升趨勢，遠高于國際水平的2%。有研究顯示50%～60%被診斷為結直腸癌的病人將發展為結直腸癌轉移，其中80%～90%為不可切除的結直腸癌肝轉移患者[2]。結直腸癌主要的治療方法是手術和放化療，但是療效并不理想。隨著現代腫瘤醫學的快速發展、分子靶向藥物的研發和個體化治療的應用，使結直腸癌的治療進入了分子靶向治療的新時期。Ⅱ期和Ⅲ期臨床隨機試驗結果顯示, 使用抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體(西妥昔單抗、帕尼單抗)治療轉移性結直腸癌，其療效與KRAS基因有無突變密切相關[3-5]。KRAS基因野生型患者可從抗EGFR單抗單藥治療或聯合化療中獲益，但KRAS基因第2號外顯子的第12或13位密碼子發生突變者不能受益。因此，美國《國家綜合癌癥網絡(NCCN)結直腸癌臨床實踐指南》(2012)中明確提出，KRAS基因狀態是使用EGFR單抗靶向藥物的療效預測指標，KRAS野生型患者可接受EGFR抑制劑的治療，對于KRAS基因無突變(野生型)患者，建議檢測BRAF基因，有BRAF V600E突變的患者可能對EGFR單抗靶向藥物治療無效。鑒于KRAS和BRAF基因對于指導結直腸癌患者臨床用藥的重要性，本研究采用PCR擴增-直接測序的方法檢測分析新疆維、漢族轉移性結直腸癌患者KRAS及BRAF基因的突變情況,并探討其與臨床病理特征和預后的關系。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇新疆醫科大學第一附屬醫院2005年1月-2010年12月收治的轉移性結直腸癌患者100例，其中漢族50例，維吾爾族50例；男性37例，女性63例；年齡<60歲47例，≥60歲53例。納入標準：(1)所有轉移性結直腸癌患者都在術前被相關病理及檢查所明確診斷并明確有轉移,包括實驗室檢查、胸片、腸鏡檢查、病理活檢及胸腹盆腔CT。(2)所有轉移性結直腸癌患者在術前未行新輔助治療。(3)所有轉移性結直腸癌患者都經過影像學及病理檢查評估分期。排除沒有轉移的結直腸癌患者。每例均取距腫瘤10 cm以上大腸黏膜作對照。

1.2檢測方法選取經甲醛固定和石蠟包埋的腫瘤原發灶樣本并切片，采用基因科技(上海)有限公司GTpure FFPE組織DNA提取試劑盒抽提并制備DNA模板。采用聚合酶鏈式反應擴增出KRAS第2外顯子片段，用Pyrosequencing測序法(PyroMark ID型Pyrosequencing焦磷酸測序儀(瑞典Biotage AB公司產)檢測該位點是否突變。

1.3KPS評分標準對患者的預后情況進行KPS評分。0～49分：生活不能自理,需特別照顧;50～79分：生活可自理,但不能維持正常活動或工作;80～100分：可正常工作,有輕微癥狀或體征。

1.4統計學處理所有資料采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析，卡方檢驗計算KRAS和BRAF基因在新疆維、漢轉移性結直腸癌患者中相關臨床病理參數的突變差異。Kaplan-Meier方法計算生存率，單因素分析采用Log-rank進行比較；生存率的多因素分析采用Cox風險模型逐步回歸方法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1隨訪結果與總生存情況所有病例均獲隨訪。隨訪時間1～63個月，中位隨訪時間為24個月。失訪3例，失訪率為3%。 截止2012年12月30日，100例患者中有3例患者存活，1年、2年、3年、5年生存率分別為50.70%、28.80%、13.10%、1.50%，中位生存時間為12個月，生存曲線圖見圖1。

圖1　維、漢族結直腸癌伴肝轉移患者的生存曲線圖

2.2KRAS基因突變情況及其類型100例樣本中KRAS突變28例，突變率為28%；BRAF突變5例，突變率為5%。50例漢族患者中KRAS基因突變18例, BRAF基因2例；50例維吾爾族患者中KRAS基因突變10例，BRAF基因突變3例。KRAS基因第12位密碼子的突變類型有GGT>GAT、GGT>G3T、GGT>AGT、GGT>TGT、GGT>GCT、GGT>CGT，第13位密碼子的突變類型有GGC>GAC、GGC>TGC。BRAF基因最常見的突變類型為V600E。

2.3單因素分析結果單因素分析結果顯示：原發腫瘤組織學分級、區域淋巴結轉移、脈管瘤栓、肝外侵犯或轉移、KRAS和BRAF均對預后有影響。原發腫瘤分化程度低者、有淋巴結轉移者、有脈管瘤栓者、有肝外受侵者較無淋巴結轉移者、無脈管瘤栓者及無肝外受侵者較者預后差，KRAS野生型較突變型預后相對差和BRAF野生型較突變型預后相對差；而患者性別、年齡、族別、KPS評分、原發腫瘤T分期、肝轉移灶部位、肝轉移灶最大直徑、肝轉移灶數目及腫瘤大體類型對預后無影響(P均>0.05),見表1。

表1　100例新疆維漢民族結直腸癌伴肝轉移患者預后影響因素的單因素分析結果

2.4多因素分析結果將單因素分析中有意義的6個因素作自變量，生存時間作應變量，應用COX模型進行多因素分析后發現脈管瘤栓(圖2)、KRAS (圖3)為獨立的預后危險因素(P<0.05)(表2)。

圖2　脈管瘤栓與新疆維漢民族結直腸癌伴肝轉移

患者的累計生存曲線圖

圖3　KRAS基因與新疆維漢民族結直腸癌伴肝轉移

患者的累計生存曲線圖

表2　維、漢族結直腸癌伴肝轉移患者多因素分析結果

3討論

本研究單因素及多因素分析結果顯示，脈管瘤栓是新疆維、漢族結直腸癌伴肝轉移患者預后的獨立影響因素。這與國內外有關研究報道的結果相一致[6-7]。Nissan等[7]研究發現脈管瘤栓顯著降低5年無病生存率(36%)和疾病特異性生存率(37%)。脈管指管徑<300 μm的小動脈、小靜脈和小的淋巴管，由于在光鏡下不易區分，被籠統地稱之為脈管。在腫瘤生長過程中，有大量的腫瘤微血管形成，為瘤細胞進入血液創造了良好的解剖學基礎。一旦脈管內的瘤細胞自身形成同聚物或與白細胞、血小板形成異聚合物，即形成了脈管瘤栓[8]。脈管瘤栓進入黏膜下血管可以預測早期結直腸癌淋巴結轉移，而侵入到血管外可以增加肝轉移的風險，提示一般狀況好的患者可以更好地耐受治療，獲得更多的治療機會，從而延長生存期；而出現脈管瘤栓的患者，雖然尚未出現腫瘤的影像學改變，但已有遠處播散的趨勢，預后較差。特別是脈管瘤栓可以獨立預測結直腸癌患者發生肝轉移的風險,但是目前由于此類組織標本的缺乏，其相關機制還不是很清楚。

Roth等[9]報道約40%的結直腸癌患者中KRAS基因發生突變，主要集中在第二外顯子的第12和13密碼子上。KRAS基因作為結直腸癌中能夠預測抗表皮生長因子受體的分子靶向治療療效的標記物已被廣泛認可，但對其是否能夠預測結直腸癌的預后仍存在爭議[10]。肝轉移是結直腸癌患者治療的重點和難點，也是患者最重要的死亡原因之一[11]。對KRAS基因突變作為結直腸癌伴肝轉移預后的標志物亦存在矛盾和爭議。Petrowsky等[12]對小樣本的回顧性研究中未發現KRAS基因對于患者生存的影響，而2個大的多中心協作性研究“RASCAL Ⅰ&Ⅱ”分析了2 721例和4 268例結直腸癌患者的臨床資料，結果發現KRAS突變增加了腫瘤復發及死亡的風險，尤其是對Duke C期患者是影響無進展生存和總體生存的獨立危險因素。需要強調的是，RASCAL研究沒有報道單因素生存分析結果，多因素分析中未包括肝臟轉移發生的情況以及是否接受手術治療等對于預后的影響。此外，手術切除肝臟轉移灶是治愈結直腸癌肝轉移的最佳治療方式[13-14]。梁立等[15]根據將轉移灶是否接受手術切除進一步分組分析，結果提示，在無肝轉移組中KRAS基因突變者腫瘤總生存期較短，在肝轉移灶切除者中KRAS突變者無復發生存時間較短，且是影響肝轉移組中轉移灶切除術后總體生存的獨立危險因素。與Cejas等[16]研究結果相似。但是在同時性轉移亞組、異時性轉移亞組中預后的差異未見統計學意義，可能與樣本例數較少及隨訪時間較短有關。本研究單因素及多因素分析結果顯示KRAS基因是新疆維、漢族結直腸癌伴肝轉移患者獨立的預后因素，這與Conlin等[17]的研究結果相似，提示KRAS基因突變是獨立于結直腸癌分期的不良預后因素。

綜上所述，本研究發現脈管癌栓、KRAS是影響新疆維漢結直腸癌伴肝轉移的重要因素。但新疆維、漢結直腸癌伴肝轉移預后影響因素及其相對危險度的最終結論，尚需通過大樣本的前瞻性研究進一步驗證。

參考文獻：

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin ，2013，63(1):11-30.

[2] Van Cutsem E，Nordlinger B，Adam R，et al.Towards a pan-European consensus on the treatment of patients with colorectal liver metastases[J].Eur J Cancer， 2006，42(14):2212-2221.

[3] Karapetis CS，Khambata-Ford S，Jonker DJ，et al．K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer[J]．N Engl J Med，2008，359(17)：1757-1765．

[4]Amado RG，Wolf M，Peelers M，el al．Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer[J]．J Clin Oncol，2008，26(10)：1626-1634．

[5] Peeters M，Price TJ，Cervantes A，et al．Randomized phaseⅢ study of panitumumab with fluorouracil．1eucovorin．and irinotecan(FOLFIRI) compared with FOLFIRI alone as second-line treatment in patients with metastatic colorectal cancer[J]．J Clin Oncol,2010，28(31)：4706-4713．

[6] 方樺，王興元.300例結直腸癌肝轉移患者的臨床預后分析[J].中華腫瘤雜志, 2009, 31(3):220-222.

[7] Nissan A,Stojadinovic A,Shia J,et al.Predictors of recurrence in patients with T2 and early T3,N0 aden,ocarcinoma of the rectum treated by surgery alone[J].J Clin Oncol，2006.24(25):4078-4084.

[8] Washington MK,Berlin J,Branton P,et al.Protocol for the examination of speciments from patients with primary carcinoma of the colon and rectum[J].Arch Pathol Lab Med,2009,133(10):1539-1551.

[9] Roth AD,Tejpar S,Delorenzi M,et al.Prognostic role of KRAS and BRAF in stageⅡand Ⅲ resected colon cancer:results of the translational study on the PETACC-3,EORTC 40993,SAKK60-00 trial[J].J Clin Oncol, 2010,28(3):466-474.

[10] Bruin SC,He Y,Mikolajewska-Hanclich I,et al.Molecular alterations associated with liver metastases development in colorectal cancer patients[J].Br J Cancer,2011,105(2):281-287.

[11] Van den Eynde M,Hendlisz A.Treatment of colorectal liver metastases:a review[J].Rev Recent Clin Trials,2009,4(1):56-62.

[12]Petrowsky H,Sturm I,Graubitz O,et al.Relevance of Ki-67 antigen expression and K-ras mutation in colorectal liver metastases[J].Eur J Surg Oncol,2001,27(1):80-87.

[13]Bentrem DJ,Dematteo RP,Blumgart LH.Surgical therapy for metastatic disease to the liver[J].Annu Rev Med,2005,56(8):139-156.

[14]Hur H,Ko YT,Min BS,et al.Comparative study of resection and radiofrequency ablation in the treatment of solitary colorectal liver metastases[J].Am J Surg,2009,197(6):728-736.

[15]梁立，韋燁，鐘蕓詩.K-ras基因突變與結直腸癌肝轉移及其預后關系的研究[J].中華胃腸外科雜志，2012,15(11):1156-1161.

[16]Cejas P,Lopez-gomez M,Aguayo C,et al.KRAS mutations in primary colorectal cancer tumors and related metastases:a potential role in prediction of lung metastasis[J].PloS One,2009,4(12):e8199.

[17]Conlin A，Smith G，Carey FA，et a.The prognostic significance of Kras， and APC mutations in colorectal carcinoma[J]．Gut, 2005,54(9):1283-1286.

(本文編輯楊晨晨)