苦豆子總生物堿對小鼠乳腺癌4T1細胞體外增殖抑制及誘導凋亡作用的研究

苦豆子總生物堿對小鼠乳腺癌4T1細胞體外增殖抑制及誘導凋亡作用的研究

李建光1， 牛清芝2， 楊曉藝1， 曾誠3， 黃偉4

(1新疆醫科大學藥學院， 烏魯木齊830011;2中國石油烏魯木齊石化公司職工醫院藥械科， 烏魯木齊830019;

3新疆醫科大學中醫學院， 烏魯木齊830011;4中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所藥物制劑研究室， 北京100050)

摘要：目的研究苦豆子總生物堿對小鼠乳腺癌4T1細胞體外增殖抑制及誘導凋亡作用。方法苦豆子總生物堿提取并純化，處理成澄清的藥物溶液后用于細胞給藥。CCK-8法測定不同濃度的苦豆子總生物堿作用24 h后4T1細胞存活率。流式細胞術檢測給藥24 h后4T1細胞凋亡率。結果與對照組比較，實驗組藥物濃度為5.00 mg/mL時，4T1細胞存活率為63.05%；藥物濃度為10.00 mg/mL時，4T1細胞存活率為20.30%,隨著給藥濃度的增加，細胞存活率呈明顯下降趨勢。實驗組藥物濃度為6.25 mg/mL時，細胞凋亡率為11.4%；藥物濃度為10.00 mg/mL時，細胞凋亡率為41.7%,隨著給藥濃度的增加，細胞凋亡率明顯增加。結論苦豆子總生物堿能誘導細胞凋亡，對小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖有明顯抑制作用。

關鍵詞：苦豆子總生物堿； 4T1細胞； 細胞增殖； 抑制； 細胞凋亡

中圖分類號：R961文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.010

[收稿日期：2014-09-21]

基金項目：新疆醫科大學科研創新基金(XJC2012134)

作者簡介：潘燕(1975-)，女，碩士，副主任醫師，研究方向：腦血管疾病及周圍神經病的診治，E-mail：panyan786016@sina.cn。

基金項目：新疆醫科大學第一附屬醫院科研獎勵基金(2011YFY11)； 吳階平醫學基金(320.6799.1143)； 烏魯木齊市科技技術計劃項目烏市感染與腫瘤重點實驗室(H111313001)

作者簡介：孫毅(1982-)，男，碩士，住院醫師，研究方向:腫瘤的基礎及臨床研究工作。

Proliferation inhibition and apoptosis induction effects of total alkaloid of

Sophora Alopecuroides on mouse mammary tumor 4T1 cells in vitro

LI Jianguang1, NIU Qingzhi2, YANG Xiaoyi1, ZENG Cheng3, HUANG Wei4

(1CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；2Departmentof

Pharmacy,WorkersHospital,ChinesePetroleumUrumqiPetrochemicalCorporation,

Urumqi830019,China;3CollegeofTraditionalChineseMedicine,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China;4DepartmentofPharmaceutics，InstituteofMateriaMedica,

ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the proliferation inhibition and apoptosis effect of the total alkaloid of sophora alopecuroides (TASA) on mouse mammary tumor 4T1 in vitro. MethodsTASA was extracted and purified, and then TASA was administrated to mouse mammary tumor 4T1 cells. The inhibitory effect of TASA at different concentrations on 4T1 cells was determinated by CCK-8 assay at the time point of 24 h. The effect of TASA on 4T1 cells apoptosis was detected by flow cytometry. ResultsWith the drug concentration of 5.00 mg/mL, 4T1 cells survival rate was 63.05%, while the drug concentration reached to 10.00 mg/mL, 4T1 cells survival rate was 20.30%, which suggested that 4T1 cells survival rate significantly declined with the increase of drug concentration. With the drug concentration of 6.25 mg/mL, the apoptosis rate was 11.4%, while the drug concentration was 10.00 mg/mL, the apoptosis rate was 41.7%, which showed that apoptosis rate was increased significantly with the drug level increasing. ConclusionTASA could induce cell apoptosis of 4T1 cells, and it had a remarkable inhibitory effect on the proliferation of 4T1 cells.

Key words: total alkaloid of sophora alopecuroides; 4T1 cells; cell proliferation; inhibition; apoptosis

苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)為豆科槐屬植物，多年生草本植物[1]。別名苦豆根、苦豆草，維吾爾語稱“布亞”，現收載于《中國藥典》、《新疆中草藥》和《維吾爾藥志》等[2]。生物堿是苦豆子中主要的代表性活性成分群，目前發現的生物堿主要屬于喹諾里西啶類，包括槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐胺堿等，共計20余種[3-6]。隨著研究的不斷深入，苦豆子總生物堿在抗腫瘤方面的作用越來越受到學者們的關注。近年來研究結果表明，苦豆子中的不同生物堿成分對人胃癌 MGC-803細胞、結腸癌 SW620細胞、人紅白血病細胞株K562、肝癌細胞 HepG2、Lewis肺癌、膀胱癌細胞、前列腺癌細胞等腫瘤細胞增殖均有抑制作用[7-9]。本課題組前期研究大部分是針對生物堿單體作用于腫瘤細胞、生物堿單體與其他藥物聯合用藥作用于腫瘤細胞的研究。

乳腺癌是嚴重威脅全球女性健康的常見惡性腫瘤之一，在一些國家和地區其發病率高居女性腫瘤發病之首位，乳腺癌發病機制異常復雜，至今尚未完全闡明，因而缺乏有效的防治措施[10]。新疆是全國苦豆子主產區，可利用的自然資源豐富。苦豆子總生物堿作為具有開發前景的天然藥物組份，對其抗腫瘤作用的研究有利于充分發揮傳統民族藥在抗腫瘤方面的獨特效用。目前，苦豆子總生物堿有效部位治療乳腺癌的研究未見報道。小鼠乳腺癌細胞4T1形成腫瘤的生長及轉移特性與人類乳腺癌十分相似[11]。本研究以小鼠乳腺癌為研究對象，探討苦豆子總生物堿對4T1細胞的體外增殖抑制及誘導凋亡作用，旨在為更進一步的研究與應用提供必要的基礎和依據。

1材料與方法

1.1藥材、儀器與試劑苦豆子(由新疆藥物研究所提供，經新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為真品)。調溫電熱套(KDM型，山東省鄄城永興儀器廠)，旋轉蒸發器(RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-4型，北京市永光明醫療儀器廠)，離心機(BY-400C-1型，北京白洋醫療器械有限公司)，臺式高速冷凍離心機(TGL-16K型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，酶標儀(MODEL550型，日本BIO-ROD公司)，流式細胞儀(Epics Altra型，beckman coulter公司)，超凈工作臺(BCM-1300A，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，CO2培養箱(HERAcell 150i，Thermo Fisher公司)。大孔吸附樹脂(HPD500型，滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，0.25%胰酶(批號：140609，北京協和細胞資源中心)，胎牛血清(批號：20130511，蘭州百靈生物技術有限公司)，1640培養液(批號：201305，Thermo Fisher公司)，CCK-8(批號：JA611，DOJINDO laboratories)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號：NB8826，欣博盛生物公司)。

1.2細胞小鼠乳腺癌4T1細胞株由中國醫學科學院藥物研究所黃偉副研究員贈予。

1.3方法

1.3.1苦豆子總生物堿的提取與純化苦豆子藥材粉碎成粗粉，按料液比1∶8 ( m/V )加入70%乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并濾液抽濾，濾液65℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至每1 mL濃縮液含生藥0.4 g，采用HPD500型大孔吸附樹脂進行分離純化，吸附速度1～2 BV/h，吸附時間>6 h，用蒸餾水洗脫4 BV后用40%乙醇洗脫5 BV，洗脫速度1～3 BV/h，收集40%乙醇洗脫液，濃縮干燥，得苦豆子總生物堿純化物粉末，置于干燥器中備用。

1.3.2苦豆子總生物堿藥物溶液的配制取苦豆子總生物堿純化物粉末加入PBS中溶解，配制成濃度為25 mg/mL的藥物溶液，完全溶解后于離心機中離心，12 000 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm無菌濾膜過濾，即得用于細胞給藥的澄清藥物溶液。

1.3.3細胞存活率測定采用CCK-8法測定不同濃度苦豆子生物堿藥物溶液作用24 h后4T1細胞存活率。將細胞融合度達到95%的對數生長期4T1細胞接種于96孔板中(100 μL/孔)，置于5%CO2、37℃培養箱中，培養24 h細胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的藥物溶液。實驗設空白組、對照組和實驗組。空白組按100 μL/孔加入含10% FBS的1640培養液，設6個復孔；實驗組分別加入5.00、10.00 mg/mL濃度的藥物溶液100 μL，每個濃度均設6個復孔；對照組設6個復孔，每孔加入細胞懸液100 μL(含8×103個細胞)。繼續培養24 h后，每孔加入10%CCK-8和細胞培養混合溶液100 μL，繼續孵育3 h，采用酶標儀于450 nm處測定吸收值，并以650 nm為參考波長，計算細胞存活率，公式如下：

細胞存活率=[1-(OD實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%

1.3.4細胞凋亡檢測采用流式細胞術檢測不同濃度苦豆子總生物堿藥物溶液作用24 h后4T1細胞凋亡率。取對數生長期的4T1細胞，經胰酶消化得單細胞懸液，1 100 r/min離心4 min，收集細胞，用含有10% FBS的1640培養液調整細胞密度，以1×105個/孔加入12孔板，1 mL/孔，37℃、5% CO2細胞培養箱培養24 h。對照組設4個復孔，實驗組分別加入6.25、10.00 mg/mL濃度的藥物溶液100 μL，每個濃度設3個復孔。37℃、5% CO2細胞培養箱培養24 h后，用5 mL EP管收集各組細胞。吸取細胞培養液，PBS洗滌1次，收集洗滌液，加入0.5 mL胰酶消化細胞，加入1 mL培養液來回吹打20次，收集培養液，1 100 r/min離心4 min，吸去上清液，加入1 mL PBS洗滌，此過程重復2次，加結合液500 μL混合均勻，吹打均勻。室溫避光操作，加Annexin V-FITC 5 μL混合均勻，再加PI 5 μL混合均勻，室溫避光染色15 min，過300目篩網，上流式細胞儀檢測。

2結果

2.1苦豆子總生物堿對4T1細胞增殖的抑制作用與對照組未經處理的4T1細胞相比，實驗組藥物濃度為5.00 mg/mL時，4T1細胞存活率為63.05%；藥物濃度為10.00 mg/mL時，4T1細胞存活率為20.30%。相同作用時間增加給藥濃度，細胞存活率明顯下降(圖1)。

圖1　不同濃度苦豆子總生物堿作用24 h后4T1細胞存活率

2.2苦豆子總生物堿對4T1細胞凋亡的影響實驗組藥物溶液濃度為6.25 mg/mL時， 4T1細胞凋亡率為11.4%；藥物溶液濃度為10.00 mg/mL時， 4T1細胞凋亡率為41.7%。與對照組相比，實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組，且隨著給藥濃度的增加，細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增加(圖2)。

A: 對照組

B: 6.25 mg/mL藥物溶液

C: 10.00 mg/mL藥物溶液

圖24T1細胞給藥后凋亡檢測結果

3討論

本研究采用CCK-8法測定細胞存活率，結果表明，苦豆子總生物堿對小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖有明顯的抑制作用。細胞凋亡是主要抗癌作用機制之一[12]。研究發現，細胞凋亡的信號轉導通路中包含著2條主要途徑，即外源性通路(主要由死亡受體介導)與內源性通路(主要通過線粒體相關蛋白活化)[13]。本實驗對4T1細胞的活性進行檢測，結果顯示，4T1細胞的存活率隨苦豆子總生物堿給藥濃度的增加而減小；根據流式細胞術分析可知，苦豆子總生物堿作用后，實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組，且隨著給藥濃度的增加，細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增加。苦豆子總生物堿能夠促進腫瘤細胞的凋亡，抑制小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖。

苦豆子生物堿抗腫瘤作用機制廣泛，涉及多個途徑，而且可能是多途徑同時起作用而達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。隨著研究的深入，將有更多新的苦豆子生物堿抗腫瘤作用機制不斷被發現。苦豆子生物堿對多種癌細胞有較好的抑制活性，對部分癌細胞顯示出較為特殊的抗癌機制，可見苦豆子總生物堿可能是一種廣譜抗癌組合物，也是一種值得深入研究和作為抗癌藥物模型的組合物。針對目前苦豆子中生物堿抗腫瘤作用機制研究較為分散，且對不同的腫瘤細胞顯示出多種作用機制，在未來的研究工作中應選取適當的腫瘤細胞進行針對性研究，以及針對某一腫瘤細胞進行多機制的探索研究。

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(本文編輯施洋)

通信作者：包永星，女，博士，教授，博士生導師，研究方向:腫瘤綜合治療的研究工作,E-mail：baoyx@vip.sina.com。