慢性乙肝攜帶者HBV DNA載量與細胞免疫功能間關系研究

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慢性乙肝攜帶者HBV DNA載量與細胞免疫功能間關系研究

張韜，張麗娟，張躍新

(新疆醫科大學第一附屬醫院感染科，新疆維吾爾自治區烏魯木齊830054)

【摘要】目的:探討慢性乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者的HBV-DNA載量與細胞免疫功能的關系。方法:選擇本院診治的HBV攜帶者為觀察組(90例)，根據熒光定量PCR法測定HBV-DNA含量分為陰性組(14例)、低拷貝組(49例)、高拷貝組(27例)，同期體檢合格的健康人群為對照組(90例)，觀察各組受試者外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分比和CD4+/CD8+值，外周血B淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)、活化T細胞比例，及CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表面的PD-1陽性率和PD-1平均熒光強度。結果:觀察組患者CD3+、CD4+百分比、CD4+/CD8+值、NK細胞比例均低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，CD8+百分比、CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表面的PD-1陽性率和PD-1平均熒光強度高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)。隨著HBV-DNA病毒拷貝數的增加，CD3+、CD4+百分比、CD4+/CD8+值、NK細胞比例降低(P＜0.05或P＜0.01)，CD8+百分比、CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表面的PD-1陽性率及PD-1平均熒光強度上升(P＜0.05或P＜0.01)。結論:慢性乙型肝炎病毒攜帶者的HBV-DNA病毒載量與外周紊亂的T淋巴細胞之間存在密切聯系，臨床可動態監測HBV-DNA病毒載量與T淋巴細胞的變化，以指導臨床治療。

【關鍵詞】乙型肝炎病毒;病毒載量;細胞免疫; T細胞亞群;自然殺傷細胞

乙型肝炎病毒(HBV)是一種非細胞毒性的嗜肝病毒，HBV感染可逐漸發展為慢性肝炎，引起嚴重的肝臟組織的纖維化和硬化，最終發展為肝硬化甚至肝癌，嚴重威脅著人類的生命健康［1-2］。機體細胞功能紊亂在慢性乙型肝炎的發病中起重要作用，尤其是各種免疫細胞，機體有不同的T淋巴細胞亞群構成，外周T細胞亞群的紊亂可使機體清除HBV能力降低，引起慢性肝臟炎癥和細胞損傷［3-4］。HBV-DNA水平是反應病毒在機體內復制的重要指標，為全面了解和認識不同HBV-DNA病毒載量患者的細胞免疫功能的改變，旨在為全面了解HBV感染與肝臟疾病發生發展中細胞免疫功能的改變提供理論依據，現報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年3月至2014年3月在本院診治的HBV攜帶者90例，設為觀察組。均符合《病毒性肝炎防治方案》診斷標準和《慢性乙型肝炎防治指南》中HBV攜帶者的診斷標準［5-6］。排除患有甲、丙、丁、戊型等肝炎，其他病毒感染、結核、自身免疫性肝病、酒精及藥物性肝炎及在6個月內接受免疫調節劑和抗病毒治療的患者。年齡16～70歲，平均(42.3±10.2)歲;病程7個月～11年。根據熒光定量PCR法測定HBV-DNA載量分為陰性組、低拷貝組、高拷貝組，即HBV-DNA拷貝數小于102 copies/mL為陰性組(14例)，HBV-DNA拷貝數小于103～104 copies/mL為低拷貝組(49例)，HBV-DNA拷貝數小于105～108 copies/mL為高拷貝組(27例)。選取同期體檢合格的健康人群為對照組(90例)，均無肝炎病史、乙型肝炎標志物測定均陰性。各組受試者性別、年齡等一般資料差異無統計學意義(P＞0.05)。經本院倫理委員會同意，所有患者均知情同意。

1.2方法

受試者入院后于次日清晨空腹抽取靜脈血6 mL，分為3管，每管2 mL，其中2管用于分離血清，另1管加入含有40 μL的10％EDTA二鈉和抑肽酶1 000 KU/mL的聚丙烯試管，高速低溫離心，分離血漿，置于-70℃保存。(1)2 mL血清采用酶聯免疫法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb等乙肝標志物，試劑盒購自Abbott公司，嚴格按照操作說明書進行。(2)2 mL血清用于檢測HBV-DNA含量，采用美國ABl5700熒光定量聚合酶鏈反應檢測儀檢測，引物均由深圳匹基公司提供。(3)外周T細胞亞群測定采用FACSCalibur流式細胞儀測定，取100 μL的抗凝血于流式專用試管中，加入美國Benton Dinckinson公司提供的CD3+、CD4+、CD19+、CD3+、CD16+或CD56+、活化T細胞(CD3+HLA-DR+)單克隆熒光抗體20 μL。依次進行避光、紅細胞溶解、離心等，分別進行淋巴細胞的百分比統計。程序性死亡受體-1-藻紅蛋白(PD-1-PE)購自美國eBioscience公司，流式細胞技術測定CD4+和CD8+等淋巴細胞表面PD-1的表達。

1.3觀察指標

觀察各組受試者外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分比和CD4+/CD8+值，外周血B淋巴細胞、NK細胞、活化T細胞比例，及CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表面的PD-1陽性率和PD-1平均熒光強度。

1.4統計學分析

統計學分析應用SPSS19.0軟件，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗分析組間差異，計數資料采用百分率表示，采用χ2檢驗分析組間差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組受試者外周血T細胞亞群水平比較

觀察組患者CD3+，CD4+百分比和CD4+/CD8+值均低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，CD8+百分比高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)。隨著HBV-DNA病毒拷貝數的增加，CD3+，CD4+百分比和CD4+/CD8+值降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，CD8+百分比升高，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1　各組受試者外周血T細胞亞群水平比較(±s)

表1　各組受試者外周血T細胞亞群水平比較(±s)

* P＜0.05，＊＊P＜0.01，與對照組比較; #P＜0.05，##P＜0.01，與DNA陰性組比較;△P＜0.05，△△P＜0.01，與DNA低拷貝組比較。

組別　CD3+(％)　CD4+(％)　CD8+(％)　CD4+/CD8+值對照組(n =90)70.7±14.2　47.6±8.5　26.7±7.2　1.7±0.6觀察組(n =90)　65.5±9.1＊＊　35.8±7.4＊＊　32.4±7.9＊＊　1.1±0.3＊＊DNA陰性組(n =14)　69.8±12.3　41.3±7.4*　30.9±7.8*　1.4±0.4 DNA低拷貝組(n =49)　62.4±10.1＊＊#　34.0±5.8＊＊##　35.8±8.1＊＊#　1.0±0.5＊＊##DNA高拷貝組(n =27)　54.4±9.2＊＊##△△　25.8±6.4＊＊##△△　39.7±7.8＊＊##△　0.7±0.4＊＊##△△

2.2各組受試者外周血B淋巴細胞、NK細胞、活化T細胞比例比較

觀察組患者NK細胞比例低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，B淋巴細胞、活化T細胞比例與對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。隨著HBVDNA病毒拷貝數的增加，NK細胞比例下降，差異有統計學意義(P＜0.01)，但B淋巴細胞、活化T細胞的比例差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2　各組受試者外周血B淋巴細胞、NK細胞、活化T細胞比例比較(±s)

表2　各組受試者外周血B淋巴細胞、NK細胞、活化T細胞比例比較(±s)

* P＜0.01，與對照組比較; #P＜0.01，與DNA陰性組比較;△P＜0.01，與DNA低拷貝組比較。

組別　B淋巴細胞(％)　NK細胞(％)　　活化T細胞(％)對照組(n =90)10.3±4.2　18.7±7.2　20.5±9.8觀察組(n =90)　10.7±5.1　10.5±4.2*　19.9±8.9 DNA陰性組(n =14)　10.5±4.3　11.2±4.3*　20.1±7.7 DNA低拷貝組(n =49)　10.9±4.1　8.0±3.8* #　20.3±7.9 DNA高拷貝組(n =27)　10.8±5.1　5.8±2.5* #△19.7±5.3

2.3各組受試者外周血T細胞表面PD-1水平比較

觀察組患者CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表面的PD-1陽性率和PD-1平均熒光強度高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)。隨著HBVDNA病毒拷貝數的增加，CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表面的PD-1陽性率和PD-1平均熒光強度上升，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表3。

表3　各組受試者外周血T細胞表面PD-1水平比較(±s)

表3　各組受試者外周血T細胞表面PD-1水平比較(±s)

* P＜0.05，＊＊P＜0.01，與對照組比較; #P＜0.05，##P＜0.01，與DNA陰性組比較;△△P＜0.01，與DNA低拷貝組比較。

組別　CD4+T淋巴細胞PD-1陽性率(％)　PD-1平均熒光強度CD8+T淋巴細胞PD-1陽性率(％)　PD-1平均熒光強度對照組(n =90)12.5±4.3　0.7±0.4　10.3±3.6　0.8±0.4觀察組(n =90)　18.3±5.2＊＊　1.9±0.6＊＊　16.9±4.2＊＊　1.7±0.5＊＊DNA陰性組(n =14)　13.5±3.9　1.0±0.6*　12.0±4.1　1.2±0.4＊＊DNA低拷貝組(n =49)　18.7±4.2＊＊##　1.9±0.5＊＊##　16.8±5.1＊＊##　1.7±0.7＊＊#DNA高拷貝組(n =27)　22.3±4.9＊＊##△△　2.8±0.8＊＊##△△　23.5±6.8＊＊##△△　2.4±0.9＊＊##△△

3　討論

HBV并不能直接損害正常的肝細胞，但HBV感染可誘導機體形成慢性化的感染，機體形成持續性的耐受和激活特異性免疫應答。如果機體免疫功能較強，則可清除病毒，機體得以恢復，表現為急性感染，如果機體免疫功能下降，機體會形成慢性HBV感染，使肝臟發生纖維化和硬化，嚴重威脅著人類的生命健康［7］。HBV-DNA水平是反應機體HBV感染的指標，其水平高低代表了其復制和感染能力，也代表了機體HBV的病毒載量［8］。正常的外周淋巴細胞群對維持機體正常的免疫功能發揮著重要作用。一旦發生感染，機體的淋巴細胞亞群的數量和功能則會發生紊亂，尤其是T細胞亞群的紊亂使機體不能有效清除HBV，使HBV在機體內持續復制的重要原因，加重慢性乙型肝炎患者的病情［9-10］。

本研究發現，與對照組相比，慢性乙型肝炎病毒攜帶者的CD3+、CD4+、CD8+的百分比和CD4+/CD8+值差異有統計學意義。CD3+水平下降說明了機體參與免疫應答的免疫活性細胞數量不足，主要是由于慢性乙型肝炎病毒攜帶者在長期受到HBV感染的情況下，T淋巴細胞發生免疫耐受或啟動凋亡程序，T淋巴細胞的激活變為抑制效應［11-12］。CD4+細胞主要在免疫應答中起輔助誘導作用，CD4+水平下降可引起機體細胞免疫功能下降，機體清除HBV的能力下降，加重患者的病情。CD4+/CD8+是反應機體細胞免疫功能的直接指標，當機體免疫功能紊亂時或機體出現一系列的免疫病理改變時CD4+/CD8+往往出現失衡，CD4+/CD8+比值下降主要是由于CD8+細胞增多所致，研究發現在慢性乙型肝炎患者肝臟活檢中發現肝小葉壞死區存在大量的CD8+細胞，提示CD8+細胞增多在肝細胞免疫損害中發揮了重要作用［13-14］。進一步研究發現與健康對照組相比，隨著HBV-DNA病毒拷貝數的增加，CD3+細胞、CD4+細胞百分比和CD4+/CD8+百分比顯著降低。提示隨著HBV-DNA復制的增多，機體免疫功能下降更為嚴重，外周T細胞亞群失衡，進一步增加HBV侵入的機率，機體對HBV清除的能力下降，HBV復制越多，則進一步加劇外周T細胞亞群失衡，二者相互促進。因此臨床上可通過抑制HBV復制來改善機體的細胞免疫功能，提高機體對HBV清除的能力。

外周血B淋巴細胞約占總淋巴細胞的10％～15％，可產生具有抗體活性的免疫球蛋白，CD19+是B淋巴細胞的重要標志。NK細胞是自然殺傷細胞，在機體免疫中也發揮了重要作用。本研究發現，慢性乙型肝炎病毒攜帶者的B淋巴細胞無顯著改變，但NK細胞顯著下降，且隨著HBV-DNA復制的增加，NK細胞下降越嚴重，這就更加重了機體細胞免疫功能的紊亂，加劇HBV-DNA的感染。葉玲麗等［15］研究發現，與健康對照組相比，慢性乙型肝炎患者的CD4+/CD8+明顯下降，NK細胞也顯著降低，與HBV-DNA呈負相關，與本研究結果相似。PD-1是近年來發現的負性共刺激信號分子，HBV感染時PD-1和PD-1的配體(PD-L)通路受到限制，T細胞和B細胞的增殖和活化受到抑制，白細胞介素(IL-2、IL-10)和γ干擾素(IFN-γ)分泌也會隨之減少。本研究發現，與對照組相比，慢性乙型肝炎病毒攜帶者的CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表面的PD-1陽性率和PD-1平均熒光強度顯著增加，提示CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表面高表達PD-1參與了慢性乙型肝炎的發病過程。

綜上所述，慢性乙型肝炎病毒攜帶者的HBVDNA病毒載量與外周紊亂的淋巴細胞之間存在密切聯系。提示慢性乙型肝炎病毒攜帶者存在嚴重的細胞免疫功能紊亂，HBV-DNA病毒復制活躍加重免疫調節紊亂; HBV感染引起的機體持續性肝臟感染可能是通過多種特異性或非特異性的清除病毒的免疫激活，造成機體免疫功能紊亂。臨床可動態監測HBV-DNA病毒載量與T淋巴細胞的變化，以了解患者的機體免疫狀態，為臨床治療慢性乙型肝炎提供更好的指導。

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(學術編輯:熊良仕)

Study on correlation between hepatitis B virus DNA loads and cellular immunity in chronic HBV carriers

ZHANG Tao，ZHANG Li-juan，ZHANG Yue-xin

(Department of Infectious Disease，the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University，Urumchi 830054，Xinjiang，China)

【Abstract】Objective: To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV)DNA loads and cellular immunity in chronic HBV carriers.Methods: A total of 90 chronic HBV carriers as observation group assigned to negative group (n =14)，low copy group (n =49)and high copy group (n =27)according to their HBV-DNA load tested by fluorescence quantitative PCR.Another 90 health participants were enrolled as control group.The percentage of CD3+，CD4+and CD8+T lymphocyte，CD4+/CD8+，proportion of B lymphocyte and natural killer (NK)cell in peripheral blood，positive rate and mean fluorescence intensity of PD-1 on surface of CD4+and CD8+T lymphocyte were detected in all groups，respectively.Results: the percentage of CD3+and CD4+T lymphocyte，CD4+/CD8+and proportion of NK cell were significantly lower in observation group than those in control group (P＜0.01)，and the percentage of CD8+lymphocyte，positive rate and mean fluorescence intensity of PD-1 were significantly higher in observation group than those in control group (P＜0.01).The percentage of CD3+and CD4+T lymphocyte，CD4+/CD8+and proportion of NK cell were increased (P＜0.05，P＜0.01)，and the percentage of CD8+lymphocyte，positive rate and mean fluorescence intensity of PD-1 were decreased (P＜0.05，P＜0.01)，with an increase in copy of HBV-DNA increased.Conclusion: There is a potential correlation betweenbook=315,ebook=48HBV-DNA loads and cellular immunity in chronic HBV carriers.Dynamically monitoring on HBV-DNA loads and T lymphocyte can offer valuable reference to clinical treatment.

【Key words】Hepatitis B virus; Viral load; Cellular immunity; T lymphocyte subsets; Natural killer cell

通訊作者:張躍新，E-mail: zhangtao771113@163.com

作者簡介:張韜(1977-)，男，新疆庫爾勒人，碩士，主治醫師，從事肝病/傳染病方面臨床研究。

基金項目:中國高校醫學期刊臨床專項資金(11520222)

收稿日期:2015-04-10

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.03.10

【文章編號】1005-3697(2015)03-0314-04

【中圖分類號】R512.6

【文獻標志碼】A

網絡出版時間: 2015-6-19 17∶39網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150619.1739.007.html