靶向大鼠PALM3基因的RNA重組腺病毒載體構建及鑒定

靶向大鼠PALM3基因的RNA重組腺病毒載體構建及鑒定*

付玉梅1陳旭昕2韓志海1,2

(1.安徽醫科大學海軍臨床學院， 北京 100037; 2.海軍總醫院呼吸科， 北京 100037)

【摘要】目的構建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短發夾shRNA(RNA)重組腺病毒載體，干擾大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞(AE2 cells)中PALM3的表達。方法設計大鼠靶向PALM3基因的shRNA，插入穿梭質粒pGV120-EGFP，行PCR、測序鑒定；將穿梭質粒和骨架質粒共轉293細胞，進行重組腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP的包裝，并采用TCID50法測定病毒感染滴度；用此病毒感染大鼠AE2細胞，Western blot法檢測細胞內PALM3蛋白表達。結果穿梭質粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP經PCR及測序鑒定證實構建成功，進一步構建了表達大鼠PALM3基因shRNA的重組腺病毒載體Ad-palm3-shRNA-EGFP，重組腺病毒感染滴度為3× 1010 pfu/mL，感染大鼠AE2細胞后顯著抑制目的蛋白表達(P<0.05)。結論本實驗成功構建了針對大鼠PALM3基因的shRNA重組腺病毒，顯著下調了大鼠AE2細胞中PALM3的表達，為進一步探索PALM3在炎性失控性疾病中的作用奠定基礎。

【關鍵詞】短發夾RNA； paralemmin-3； 重組腺病毒載體； RNA干擾； 急性肺損傷

【中圖分類號】R 383.1+6【文獻標志碼】A

基金項目：國家自然科學基金(81300050)，海軍總醫院創新培養基金(CXPY201417)。

通訊作者：韓志海，醫學博士，副主任醫師，Tel：18600310135， E-mail：zhihaihandoctor@163.com。

收稿日期：( 2015-05-14； 編輯： 張文秀)

Construction and identification of recombinant adenovirus expressing short hairpin RNA of rat paralemmin-3FU Yumei1, CHEN Xuxin2, HAN Zhihai1,2

(1.NavyClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity,Beijing100037,China;

2.DepartmentofRespiratoryMedicine,NavyGeneralHospital,Beijing100037,China)

Abstract【】ObjectiveTo construct the recombinant adenovirus vector (Ad.V) of short hairpin RNA (shRNA) against rat paralemmin-3 (PALM3) gene and identify the effects of down-regulation of recombinant Ad.V in rat alveolar epithelial 2 cells (AE2 cells). MethodsThe short hairpin oligonucleotide and complementary strand targeting the consensus sequences of PALM3 were designed and inserted into the shuttle plasmid pGV120-EGFP. The pGV120-palm3-shRNA-EGFP was identified by PCR and DNA sequencing. Recombinant viruses were generated by using 293 packaging cells co-transfected with the shuttle plasmid and the framing plasmid. The titer of Ad-palm3-shRNA-EGFP was determined by means of 50% tissue culture infectious dose. And then the recombinant adenovirus Ad-palm3-shRNA-EGFP was used to infect the rat AE2 cells and the protein expression of PALM3 was detected by Western blot. ResultsThe PCR and DNA sequencing results demonstrated that the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP was successfully constructed. Cytopathic effect and fluorescence detection indicated that the adenovirus was successfully packaged after co-transfection. The titer of Ad-palm3-shRNA-EGFP was 3×1010 pfu/mL. The PALM3 protein expression in the rat AE2 cells was significantly decreased. ConclusionThe recombinant adenovirus vectors target to rat PALM3 are successfully constructed and packaged and it could obviously knockdown the expression of PALM3 in the rat AE2 cells, which offers a basis for further research on the role of PALM3 in inflammatory diseases.

【Key words】Short hairpin RNA; Paralemmin-3; Recombinant adenovirus; RNA interfering; Acute lung injury

共同第一作者：陳旭昕

Paralemmin-3 (PALM3)屬于Paralemmin蛋白家族，可能作為“接頭”分子參與Toll樣受體/白介素-1受體(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor, TIR)信號通路轉導，且與TIR信號通路中的負性調控分子單免疫球蛋白白細胞介素-1受體相關蛋白存在相互作用[1,2]。我們的前期研究發現，下調PALM3的表達可減輕人肺泡上皮細胞對LPS誘導的炎癥反應，其機制可能與阻斷TIR信號轉導而降低核轉錄因子-κB的活性有關[3]。深入研究PALM3在TIR信號通路中的作用及機制，有望為急性肺損傷等炎癥失控性疾病尋找到新的治療靶點。RNA干擾(RNA interfering, RNAi)是近年發展迅速的一項生物技術，已成為基因功能研究和基因治療的強有力工具[4]。本研究旨在以短發夾RNA(short hair RNA, shRNA)腺病毒為介導，構建靶向大鼠PALM3基因的表達載體，為后繼研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料 DH5α感受態菌株及293細胞株由本室保存，大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell，AEC) Ⅱ型AEC購自武漢普諾賽生命科技有限公司；pGV120載體及空腺病毒載體Ad-EGFP均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；DMEM、Ham’F12 細胞培養基及新生胎牛血清購自Gibco公司，Opti-MEM培養基、脂質體轉染試劑盒及Trizol購自Invitrogen公司；PCR試劑、DNA連接試劑盒、內切酶EcoRⅠ和AgeⅠ購自Takara公司，膠回收及DNA純化試劑盒購自上海生工有限公司，引物合成及AdMax腺病毒包裝系統購自加拿大Microbix公司；抗PALM3多克隆抗體均購自Santa cruz公司；GAPDH抗體、ECL-PLUS發光試劑盒、蛋白定量和細胞總蛋白提取試劑盒均為江蘇碧云天公司產品。

1.2方法

1.2.1細胞培養293細胞用于包裝和擴增腺病毒，用含有10% 胎牛血清的 DMEM 培養基，大鼠Ⅱ型AEC 細胞用含10%胎牛血清的Ham's F12 培養基在37.0℃、5% CO2及95%濕度條件下培養，隔天換液，實驗用細胞均處于對數生長期。

1.2.2大鼠PALM-3基因特異性shRNA靶序列的選擇及合成針對Genebank中大鼠PALM3基因的序列(Gene ID: 100359592)，按照RNAi序列設計原則，選擇AGATCTTGATGGAGGGTTT為干擾靶序列，由上海吉凱基因化學技術有限公司設計并合成含干擾序列的引物。退火形成雙鏈DNA oligo，在其兩端連接上EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點粘端，并BLAST同源性分析。由上海吉凱基因化學技術有限公司合成寡核苷酸序列，正義鏈為5′CCGGGGAGATCTTG ATGGAGGGTTTCTCGAGAAACCCTCCATCAAG ATCTCCTTTTTG3′，反義鏈為5′AATTCAAAAA GGAGATCTTGATGGAGGGTTTCTCGAGAAAC CCTCCATCAAGATCTCC3′。

1.2.3穿梭質粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP構建用EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切穿梭質粒pGV120，酶切產物純化后，用DNA連接酶連接線性化的pGV120及退火后的雙鏈DNA，轉化DH5α感受態細菌，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養板上過夜，挑選單克隆擴大培養，行PCR檢測，PCR反應的上游引物：5′CCATGATTCCTTCATATTTGC3′，下游引物：5′GAGGCCAGATCTTGGGTG3′；對PCR鑒定正確的陽性克隆小提質粒并送檢測序。

1.2.4重組腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP制備及滴定測定按Lipofectamine 2000脂質體說明書將骨架質粒pBHGlox_E1, 3Cre和上述穿梭質粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP共轉染293細胞，24 h后觀察EGFP表達，培養10 d后在顯微鏡下觀察細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)，當細胞中出現CPE且視野中局部或全部為綠色熒光時，表明重組腺病毒包裝成功。當90%以上細胞出現CPE時收集細胞，反復凍融3次，裂解細胞并收集病毒上清，用所收集的上清再感染293細胞進行病毒擴大生產與純化。經離子交換及過篩純化后，病毒液保存于-70℃冰箱中備用；制備1×105/mL的293細胞懸液，100μl/孔接種至96孔板，將病毒液從1×1011稀釋度開始進行8個稀釋梯度的稀釋并轉染細胞，每個稀釋度設9個復孔，并設立陰性對照，常規孵育10天，記錄細胞CPE情況。

1.2.5Western blot檢測Ad-palm3-shRNA-EGFP感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞內PALM3蛋白表達制備大鼠Ⅱ型AEC懸液，以3×105/孔接種到6孔板，細胞融合度達60~70%時，棄培養液加入病毒液Ad-palm3-shRNA-EGFP或Ad-EGFP(對照)1 mL/well到6孔板(MOI = 50)。90 min后加入20%FBS完全培養基至終體積2 mL，孵育48h。按碧云天公司細胞總蛋白提前試劑盒操作說明書，提前細胞的總蛋白，經測定蛋白濃度后，取25 μl樣品行SDS-PAGE電泳,電轉至PVDF膜, 脫脂牛奶封閉后，依次第一抗體、第二抗體結合后，ECL發光液中顯色。放入GBox-HR凝膠成像分析系統中攝像分析，用Photoshop 7.0軟件分析圖像，測定各條帶積分光密度值。以GAPDH為內參照。

2結果

2.1穿梭質粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的鑒定以含重組質粒的菌液為模板行PCR鑒定。連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為338bp，沒有連接入shRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為304bp，見圖1；挑選陽性克隆送測序，測序結果證實shRNA基因序列完全正確已成功插入質粒載體中，見圖2。

圖1重組質粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的PCR鑒定

Figure 1The identification of the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP by PCR

注：1：陰性對照(ddH2O)；2：自連對照(空載體自連對照組)；3：Marker；4：以含pGV120-palm3-shRNA-EGFP質粒菌液為模板

2.2重組腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP的包裝及滴定測定骨架質粒pBHGlox_E1, 3Cre和穿梭質粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP共轉染293細胞10 d后，在顯微鏡下可觀察到細胞病變(典型CPE現象是：細胞排列松散，多數細胞脫落，游離并呈現集攏現象，出現葡萄樣病變)，且EGFP充滿視野中的絕大多數細胞，表明腺病毒包裝成功，見圖3；梯度稀釋病毒原液，感染接種于96孔板中的293細胞，分析并記錄CPE結果，按TCID50法求得重組腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP感染滴度為3×1010pfu/mL。

2.3Ad-palm3-shRNA-EGFP感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞后PALM3蛋白表達重組腺病毒感染大鼠Ⅱ型AEC 48小時后用Western blot檢測PALM3蛋白表達，結果表明Ad-palm3-shRNA-EGFP感染后可顯著抑制PALM3蛋白表達(P<0.05)；而與正常大鼠Ⅱ型AEC相比，空腺病毒載體Ad-EGFP感染Ⅱ型AEC后PALM3蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

圖2穿梭質粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的測序結果

Figure 2Sequencing results of the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP

圖3重組腺病毒包裝過程中的細胞病變效應及EGFP表達(×100)

Figure 3The cytopathic effect of 293 cells and the expression of EGFP in the process of packaging of recombinant adenovirus

注:A: 正常生長的293細胞；B: 轉染穿梭質粒及骨架質粒10天后出現CPE的293細胞；C: 轉染穿梭質粒及骨架質粒后10天后熒光顯微鏡下觀察293細胞形態

3討論

Paralemmin蛋白家族包括四個成員：paralemmin-1，paralemmin-2，paralemmin-3及palmdephin[5]。PALM3于1992年由Cornish等首次發現報道[1]，相繼文獻報道，PALM3可能與膜蛋白的運輸或靶向有關，可能作為“接頭”分子參與信號轉導[6]。在前期研究中，我們通過酵母雙雜交系統篩選與TIR信號通路負調控分子單免疫球蛋白白細胞介素-1受體相關蛋白的相互作用蛋白[2, 7]，PALM3為被篩選出來蛋白分子之一，后經進一步免疫共沉淀驗證后，確認PALM3為單免疫球蛋白白細胞介素-1受體相關蛋白的相互作用蛋白。后繼研究中，我們以小分子干擾RNA(siRNA)為介導直接轉染人肺泡上皮細胞，結果顯示下調PALM3的表達可減輕人肺泡上皮細胞對LPS誘導的炎癥反應[3]。

圖4大鼠Ⅱ型AEC細胞中PALM3蛋白表達的Western blot分析

Figure 4The protein expression of PALM3 in the rat AE2 cells after infection

注：1.正常大鼠Ⅱ型AEC；2.感染Ad-palm3-shRNA-EGFP大鼠Ⅱ型AEC；3.感染Ad-EGFP大鼠Ⅱ型AEC

RNA沉默技術是通過導入細胞19~23 nt的小分子干擾RNA(siRNA)，降解同源mRNA，從而高效、特異性阻斷目的基因表達[8]。研究表明，短發夾RNA(shRNA)對于靶基因的干擾作用明顯優于siRNA[9]。shRNA的導入需要基因轉移載體，目前基因轉移載體主要分為病毒載體與非病毒載體，非病毒載體的安全性高，但轉染效率低，在活體組織中表達不穩定，限制了非病毒載體在在體基因功能研究中的應用。為進一步在急性肺損傷等炎性失控疾病的動物模型中研究PALM3功能與作用機理，需依賴于構建高效、穩定的基因轉移載體。重組腺病毒載體具有宿主范圍廣，分裂和非分裂細胞均可被轉染，病毒基因組不整合宿主染色體，滴定高與容載量大等優點[10]。因此，本研究中選擇腺病毒作為載體構建了針對大鼠paralemmin-3基因的shRNA重組腺病毒載體，經過對穿梭質粒的PCR、酶切及測序鑒定正確后，在293細胞中利用AdMax系統進行重組、包裝，并在大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中驗證了其干擾效率，經Western blot檢測顯示研究所構建的重組腺病毒載體Ad-palm3-shRNA-EGFP具有良好的干擾效果，顯著降低了大鼠Ⅱ型AEC中PALM3的表達水平，可以用于后繼實驗。

4結論

本研究成功構建了靶向大鼠paralemmin-3基因的shRNA重組腺病毒載體，為進一步在細胞水平及活體動物水平研究paralemmin-3基因的功能提供了良好的實驗基礎。

【參考文獻】

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