一氧化氮合酶與基質金屬蛋白酶-9在孕婦胎膜早破中的表達

一氧化氮合酶與基質金屬蛋白酶-9在孕婦胎膜早破中的表達

王占輝

(青島市膠州中心醫院產科, 山東 青島 266300)

【摘要】目的探討一氧化氮合酶(iNOS)與基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)在胎膜早破中的表達及其臨床意義。方法入選在我院進行規律產檢的90例中足月胎膜早破者30例(tPROM組)，早產胎膜早破者30例(pPROM組)，正常足月妊娠并進行剖宮產終止妊娠者30例(對照組)。分別采用免疫組織化學染色和ELISA法檢測胎膜、血清及羊水中iNOS和MMP-9的表達，并通過HE染色檢測是否患有絨毛膜羊膜炎。結果iNOS在pPROM組胎膜中的表達高于tPROM組(P<0.01)和對照組(P<0.01),在tPROM和對照組中表達無顯著差異(P>0.05)。MMP-9在PROM組胎膜、血清及羊水中的表達均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。結論iNOS和MMP-9的表達水平與PROM的發生密切相關，且iNOS和MMP-9的表達相互關聯。

【關鍵詞】基質金屬蛋白酶; 一氧化氮合酶; 早產胎膜早破; 足月胎膜早破

【中圖分類號】R 714.15+1【文獻標志碼】A

收稿日期：( 2014-01-07； 編輯： 張文秀)

The clinical significance of inducible nitric oxide synthase and matrix metalloproteinases-9 in patients with premature rupture of membranesWANG Zhanhui

(DepartmentofObstetrics,JiaozhouCentralHospitalofQingdao,Qingdao266300,Shandong,China)

Abstract【】ObjectiveTo explore the clinical significance of matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) and inducible nitric oxide synthase(iNOS) in patients with premature rupture of membranes and the relationship between MMP-9 and iNOS. Methods60 pregnant women underwent PROM and 30 women delivered by cesarean section before labor were divided into three groups due to their state: the term premature rupture of the membranes group (tPROM), the preterm premature rupture of the membranes group(pPROM), and the control group who had cesarean section without PROM. Immuno histochemical method was used to detect the expression level of MMP-9 and iNOS in fetal membranes. The level of MMP-9 in serum and amniotic fluid was detected by ELLSA. ResultsThe expression level of iNOS in fetal membranes in pPROM group was higher than that expressed in tPROM group(P<0.01) and control group(P<0.01). A statistically significant difference of the expression of MMP-9 was also found in fetal membranes(P<0.01), serum(P<0.01) and amniotic fluid(P<0.01) in PROM group than in control group. ConclusionThe expression level of iNOS and MMP-9 has close relationship with PROM.

【Key words】Matrix metalloproteinase-9; Nitric oxide synthase; Preterm premature rupture; Term preterm rupture

胎膜早破(premature rupture of membranes，PROM)是指孕婦在臨產前胎膜發生破裂，根據發生時間不同，會對母兒造成不同程度的危害。若在妊娠滿37周后出現稱為足月胎膜早破(premature rupture of membranes of term，tPROM)，在28周到37周出現稱為早產胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，pPROM)[1]。統計發現，PROM在足月妊娠和早產中的發生比例分別為10%和3.5%[2]。胎膜早破是引起早產、圍生期胎兒死亡的常見原因之一，國內外研究人員雖對其發病原因和發病機制進行了大量研究，提出多種觀點(如代謝失衡)[3]，但其確切病因及病理目前尚未完全明確。一氧化氮合酶(iNOS)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)被認為是與調節病理部位代謝密切相關的兩個因素，目前對其在癌變[4-5]、感染[6]部位的變化及作用機理研究較多，但是鮮有關于iNOS、MMP-9與PROM關系的報道。了解iNOS、MMP-9和PROM的關系對PROM的預防、診斷和治療具有重要意義。本研究旨在通過檢測MMP-9和誘導型iNOS在早產、足月胎膜早破組和正常足月妊娠組的胎膜組織中的表達，探討其與PROM發病的關系，現報告如下。

1資料與方法

1.1研究對象選取于2012年6月1日到2013年9月30日在我院進行規律產檢，并于28周以后發生胎膜早破的病例60例，其中足月胎膜早破者30例(tPROM組)，早產胎膜早破者30例(pPROM組)，選取正常足月妊娠并進行剖宮產終止妊娠者30例作為對照組。三組孕婦年齡在23～35歲之間，平均(27.93±5.48)歲，使用SPSS進行統計學分析后發現各組孕婦的年齡和孕產次均無顯著差異(P>0.05)。

1.2儀器與試劑儀器：離心機(Thermo)，酶標儀(Thermo)，石蠟包埋機(Leica)，石蠟切片機(Leica)。試劑：蘇木素伊紅染色試劑盒，iNOS兔抗人多克隆抗體，二步法抗兔、鼠通用型免疫組化檢測試劑盒，人基質金屬蛋白酶-9定量ELISA試劑盒等，以上試劑均購自北京中杉生物技術公司

1.3診斷標準分別根據孕婦最后一次月經時間準確計算孕周。PROM診斷標準參照人衛版教材《婦產科學》第七版。

1.4實驗方法與步驟

1.4.1取樣方法 在進行剖宮產手術前，首先對所有病例進行常規靜脈取血3ml，術中抽取羊水3ml，置于-4℃冰箱過夜保存，離心，取上清，置于-20℃冰箱中保存待用。胎盤娩出后取近破口處的胎膜，用PBS沖洗3次，去掉蛻膜組織和血跡。將取出的樣品分為兩份，分別用于HE染色和免疫組化染色。

1.4.2切片與染色①石蠟切片：將樣品做好標記后分別進行常規4%多聚甲醛固定，24～48h后依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片。②經常規脫蠟、水化后一部分進行HE染色，鏡檢。③按照試劑盒說明分別對切片進行iNOS、MMP-9免疫組化染色。首先將剩余樣片用血清進行封閉，分別加一抗4℃孵育過夜，后加二抗室溫孵育1h。最后進行封片，鏡檢。④用ELISA法檢測血清和羊水中iNOS和MMP-9的含量：從冰箱中取出樣品，室溫溶解后，配制標準品，然后加樣，經過孵育、洗滌、顯色、終止后，于酶標儀上450nm波長下進行吸光度(OD值)測定。⑤HE染色鏡檢每個視野中中性粒細胞浸潤情況，每個高倍鏡視野中大于11個則判斷患有絨毛膜羊膜炎。參照Fromwitz綜合記分法對免疫組化鏡檢照片進行半定量分析，并根據陽性細胞百分率及顯色深淺評分，評分標準見表1。

1.5統計學分析 對實驗中得出的數據，使用SPSS軟件對計數資料進行t檢驗分析，對等級資料進行秩和檢驗分析，相關性分析用Spearman等級相關分析,當P<0.05為差異有統計學意義。

表1　MMP-9和iNOS在胎膜組織中表達評分標準

2結果

2.1HE染色觀察通過觀察胎膜石蠟切片HE染色結果，胎膜早破患者中，感染者23人，未感染者37人；對照組中，感染者6人，未感染者24人。兩組比較無統計學意義(χ2=3.078,P=0.079)。

2.2iNOS在胎膜中的表達iNOS在pPROM組胎膜中的表達水平高于對照組，差異極顯著(P<0.01)，見表2；iNOS在tPROM組胎膜中的表達與對照組相比，差異不顯著(P>0.05)，見表3。

表2　iNOS在pPROM和對照組胎膜中的表達

表3　iNOS在tPROM和對照組胎膜中的表達

2.3MMP-9在胎膜和血清及羊水中的表達

2.3.1MMP-9在胎膜組織中的表達MMP-9在pPROM組胎膜中的表達高于對照組，差異極顯著(P<0.01)，見表4；其在tPROM組中的表達也高于對照組，差異顯著(P<0.05)，見表5；MMP-9在pPROM組和tPROM組中表達無顯著差異(P>0.05)。

2.3.2MMP-9在血清及羊水中的表達MMP-9在pPROM組血清和羊水中的表達高于對照組，差異極顯著(P<0.01)；其在tPROM組血清和羊水的表達也高于對照組，差異極顯著(P<0.01)；MMP-9在tPROM組血清中的表達高于pPROM組，表達差異顯著(P<0.05)，在羊水中差異極顯著(P<0.01)，見表6。

表4　MMP-9在pPROM和對照組胎膜中的表達

表5　MMP-9在tPROM和對照組胎膜中的表達

表6　MMP-9在血清及羊水中的表達

注：血清中pPROM組較對照組t=27.72，P=0.00；tPROM組與對照組比較t=26.24，P=0.00；pPROM組與tPROM組比較t=5.04，P=0.02；羊水中pPROM組較對照組t=0.48，P=0.00；tPROM組與對照組比較t=7.38，P=0.00；pPROM組與tPROM組比較t=0.60，P=0.00

2.4胎膜中iNOS和MMP-9的相關性分析iNOS和MMP-9在胎膜中的表達符合正相關(P<0.01)，見表7。

表7　iNOS和MMP-9的相關性

注：r=0.560；P=0.000

3討論

胎膜是一個無血管，無神經的實體，通過羊水維持其穩定性[7]，從而為胎兒提供一個穩定的發育環境。而胎膜的完整性與膠原蛋白的分泌和代謝密切相關[8]。微生物感染[9]、營養狀況不佳[10，11]、外傷、胎膜發育不良等狀況均會造成膠原的代謝失衡，從而引起胎膜早破。iNOS主要位于噬中性粒細胞、巨噬細胞，正常情況下不表達。iNOS在病理部位過量表達，引起異常部位NO濃度過高，參與體內免疫調節過程。而外源刺激持續存在，NO持續升高會導致炎癥級聯瀑布反應，進一步推動炎癥反應的發展[12]。當胎膜早破發生iNOS表達過量的NO，NO作為一種信號分子，參與抗菌，抗病毒[13]，由此進一步保護胎兒正常發育。

本實驗結果表明，iNOS在pPROM中的表達顯著高于tPROM組和對照組，由此推斷iNOS在pPROM發病中起重要作用；由tPROM組和對照組差異不顯著，推斷iNOS在tPROM的發病中不起重要作用，且pPROM和tPROM的發病機理可能并不相同。基質金屬蛋白酶(MMPs)是Zn2+依賴型的肽鏈內切酶，可降解多種細胞外基質蛋白，并且受多種生理和病理過程的調控。MMP-9可降解胎膜中的膠原，而膠原又是決定胎膜機械性能的主要成分[2]，所以MMP-9在研究PROM發病機理中至關重要。此外MMP-9可激活包括CXCL5、CXCL6、CXCL8在內的多種趨化因子配體，并可促進釋放細胞表面受體(如，腫瘤壞死因子-α受體)從而改變局部微環境[14]。MMP-9有多個炎癥相應元件，尤其是蛋白-1和NF-κB位點使其對炎癥刺激敏感[15]。本研究顯示MMP-9在pPROM和tPROM組的羊水和血清中的表達量均高于對照組，差異顯著；且其在pPROM和tPROM中的表達差異不顯著。MMP-9在三組胎膜中的免疫組化染色結果和羊水及血清中的結果相吻合，所以推斷組織中MMP-9的正常表達對維持胎膜完整性方面具有一定影響。這與前人的研究結果是一致的[16-17]。使用NO抑制劑會影響MMP-9基因的表達而抑制MMP-9的產生，從而影響胚胎著床。本實驗驗證了iNOS和MMP-9的分泌水平與PROM的發生存在關聯。研究表明NO與過氧化物陰離子反應產生的過氧硝酸根是調節助氧化劑和NO毒性作用的關鍵[18]。NO可能是通過生成過氧硝酸根來間接激活MMP-9前體[19]，從而產生大量MMP-9降解胎膜中包括膠原在內的細胞外基質蛋白，造成胎膜早破。

4結論

iNOS和MMP-9的表達水平與PROM的發生密切相關，且iNOS和MMP-9的表達相互關聯，前者能夠刺激后者的表達。同時，也可根據iNOS對MMP-9的關聯作用，使用iNOS抑制劑，間接調控MMP-9的生成，以減少PROM的發生。

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