DATS調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞P-gp及NF-κB的表達(dá)逆轉(zhuǎn)ADM耐藥性的研究

周 茜，王伏生（山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血管乳腺外科，山西 太原 030000）

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DATS調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞P-gp及NF-κB的表達(dá)逆轉(zhuǎn)ADM耐藥性的研究

周 茜，王伏生
（山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血管乳腺外科，山西 太原 030000）

【摘要】目的 研究DATS（大蒜素）逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的分子機(jī)制，是否通過抑制NF-κB的異常激活，降低P-gp表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌干細(xì)胞多藥耐藥。方法 體外貼壁培養(yǎng)及球囊培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7 及MCF-7/ADM兩種細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞的含量；球囊培養(yǎng)富集MCF-7/ADM中乳腺癌干細(xì)胞；MTT法檢測DATS對MCF-7/ADM球囊細(xì)胞（乳腺癌干細(xì)胞）及貼壁細(xì)胞（乳腺癌細(xì)胞）毒性，流式細(xì)胞術(shù)檢測DATS逆轉(zhuǎn)耐藥前后的ADM（阿霉素）對細(xì)胞毒性作用；Western blotting檢測DATS對P-gp以及NF-κB表達(dá)的調(diào)節(jié)。結(jié)果 MCF-7細(xì)胞的球囊生成率低于耐藥株，流式細(xì)胞術(shù)檢測耐藥株中CD44+CD24-細(xì)胞遠(yuǎn)高于非耐藥株。DATS作用貼壁與球囊細(xì)胞經(jīng)ADM作用24 h后凋亡增加；DATS作用下細(xì)胞P-gp與NF-κB表達(dá)下降。結(jié)論 DATS通過抑制NF-κB的異常激活，降低P-gp表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌干細(xì)胞多藥耐藥。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌干細(xì)胞；MDR；DATS；P-gp；NF-κB

乳腺癌是目前女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一。經(jīng)手術(shù)放化療后，癌癥仍轉(zhuǎn)移，多是由于腫瘤干細(xì)胞的多藥耐藥性。耐藥腫瘤細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)異常可能提示耐藥性與NF-κB（nuclear factor κB，細(xì)胞核因子κB）之間存在某種聯(lián)系[1]。P-gp可能是NF-κB下游基因之一，由于NF-κB激活轉(zhuǎn)錄，過度表達(dá)P-gp蛋白從而引起腫瘤細(xì)胞耐藥[2]。DATS(diallyl trisulfide，二烯丙基三硫化物，又稱大蒜素），作用靶點(diǎn)多且高效低毒，在逆轉(zhuǎn)耐藥方面有良好前景[3]。本課題研究DATS逆轉(zhuǎn)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞耐藥的作用，以及是否通過抑制NF-κB的異常激活，降低P-gp的表達(dá)，由此逆轉(zhuǎn)乳腺癌干細(xì)胞的多藥耐藥性。

1　資料與方法

1.1 一般資料

MCF-7細(xì)胞及MCF-7/ADM細(xì)胞、PE-兔抗人CD24單克隆抗體，F(xiàn)ITC-鼠抗人CD44單克隆抗體購于嘉美生物公司，1640培養(yǎng)基、PBS、FBS、DMOS，MTT為Amresco公司產(chǎn)品。DATS購自山東魯抗辰欣藥業(yè)、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞調(diào)亡流式檢測試劑盒、碘化丙啶購自Mbchem公司。阿霉素（ADM）購自山西醫(yī)科大學(xué)二附院。

1.2 方法

1.2.1 MCF-7及MCF-7/ADM貼壁與球囊細(xì)胞培養(yǎng)。0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞，25 cm2培養(yǎng)瓶添加培養(yǎng)基10 mL，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×103/mL。置于恒溫培養(yǎng)箱中，24 h輕晃1次，每3天采用半量換液法換液，第10日計(jì)數(shù)球囊形成率。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測MCF-7及MCF-7/ADM細(xì)胞株中細(xì)胞比例。加入FITC抗體及PE抗體各

2 μL于500 μL細(xì)胞懸液中，以2×105/L的細(xì)胞濃度重懸，取

1.2.3 采用MTT法增殖抑制法選取DATS濃度。DATS設(shè)置 5個(gè)濃度組（10、20、40、60、80 μmol/L），測定作用24 hDATS對MCF-7/ADM球囊細(xì)胞（乳腺癌干細(xì)胞）及貼壁細(xì)胞（癌細(xì)胞）的毒性。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7/ADM球囊細(xì)胞及貼壁細(xì)胞的凋亡。加入5 μmol/L的ADM和10 μmol/L的DATS，兩組細(xì)胞在37℃，5%Co2、飽和濕度下培養(yǎng)24 h。加5 μL Annexin V/FITC和10y 1（20 μg/mL）的PI溶液，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 Western blotting檢測MCF-7/ADM球囊細(xì)胞的P-gp表達(dá)變化。10%SDS-PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉，鼠抗人P-gp一抗孵育過夜，酶標(biāo)二抗室溫孵育60min，曝光。

1.2.6 NF-κB活性使用凝膠遷移電泳率實(shí)驗(yàn)（Eiectrop1oretic Moiety Slift Assay，EMSA）方法檢測：1×1011/L細(xì)胞加入核蛋白提取液A 500 μL冰上充分裂解、離心，取沉淀加入核蛋白提取液，冰浴、離心，取上清為核蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度。采用T4多核苷酸激酶末端將NF-κB探針標(biāo)記上［γ-32P］ATP。將提取的核蛋白與同位素標(biāo)記的探針在緩沖液中充分結(jié)合，行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。以積分吸光度值作為NF-κB活性的量化值。

1.2.7 不同濃度（0、10、20、40、60、80 μmol/L）的PDTC（NF-κB抑制劑）處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。提取總蛋白，進(jìn)行Western印跡分析P-gp表達(dá)。不同時(shí)間（0 h、12 h、24 h、48 h）的PDTC處理，加入20 μmol/L的PDTC，提取總蛋白，進(jìn)行Western blotting分析P-gp表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對于符合正態(tài)分布資料，兩組數(shù)據(jù)之間采用t檢驗(yàn)。對于不符合正態(tài)分布或者方差不齊的采用x2檢驗(yàn)。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

1）MCF-7細(xì)胞以及MCF-7/ADM細(xì)胞在培養(yǎng)3日后形成球囊，第10日時(shí)球囊生成率分別為（1.039±0.57%）與（10.25±0.47%），兩種細(xì)胞株中細(xì)胞的比例分別為（2.83±1.38%）和（63.93±2.31%）。MCF-7/ADM細(xì)胞株中乳腺癌干細(xì)胞含量更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

2）給予MCF-7/ADM貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞不同濃度DATS，通過MTT法檢測DATS的細(xì)胞毒性。在不同濃度的DATS處理24 h后，10、20、40 μmol/L時(shí)MCF-7/ADM貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），當(dāng)DATS濃度為60、80 μmol/L時(shí)，MCF-7/ADM球囊細(xì)胞存活率明顯高于貼壁細(xì)胞且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DATS濃度在60 μmol/L時(shí)，兩組細(xì)胞凋亡率明顯。（圖2）MCF-7/ADM貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞予以相同的化療壓力，DATS干預(yù)前后化療藥物的細(xì)胞毒作用。結(jié)果顯示加入5 μmol/L ADM 24 h后，細(xì)胞凋亡率低于聯(lián)合10 μmol/DATS細(xì)胞組（25.46±0.58，41.07±0.29）%；同樣，單純加入ADM的球囊細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平低于聯(lián)合DATS細(xì)胞組（5.42±0.31，10.30±0.79）%，以上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。只加入ADM的貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞經(jīng)24 h撤藥修復(fù)后，凋亡率分別下降（20.86±0.50，3.89±0.41）%與24 h前兩組細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。在DATS存在情況下撤除化療藥24 h后，貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞凋亡率均上升（45.11±0.67 vs 11.53±2.2）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　MCF-7（左）與MCF-7/ADM（右）球囊細(xì)胞形成

表1　流式細(xì)胞術(shù)檢測球囊細(xì)胞形成率

圖2　不同濃度DATS對MCF-7/ADM貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞24 h后凋亡率

3）MCF-7/ADM貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞P-gp吸光率在無藥物干預(yù)下分別為（0.86±0.12，0.93±0.05）；兩組細(xì)胞再加入10 μmol/LDATS后P-gp表達(dá)減弱（0.82±0.23，0.86±0.33）%，說明DATS對P-gp有抑制作用，在聯(lián)合ADM后，抑制作用更明顯（0.65±0.14，0.72±0.90）。

4）無藥物作用時(shí)，MCF-7/ADM貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞NF-κB高表達(dá)（0.82±0.05，0.89±0.15）%，10 μmol/LDATS加入后抑制NF-κB活性（0.79±0.13，0.83±0.23）%，聯(lián)合ADM后，表達(dá)減弱明顯，吸光度下降（0.62±0.09，0.67±0.03）%。

5）不同濃度、時(shí)間PDTC處理后再次使用化療藥物，對P-gp表達(dá)的影響，結(jié)果表明，不同濃度PDTC（0、20、40、60、80 μmol/L）處理時(shí)，MCF-7/ADM貼壁細(xì)胞與球囊細(xì)胞在10 μmol/L DATS聯(lián)合5 μmol/LADM和0 μmol/L PDTC比聯(lián)合80 μmol／L的PDTC處理24 h后對P-gp的表達(dá)有明顯的抑制作用；20 μmol/L的PDTC與DATS和ADM一同處理0 h、12 h、24 h、48 h后P-gp的抑制表達(dá)變化不明顯。

3　討 論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DATS在低濃度對細(xì)胞無殺傷作用情況下，能夠使化療藥物對已耐藥的細(xì)胞重新作用。那么DATS逆轉(zhuǎn)ADM耐藥機(jī)制是否通過抑制P-gp的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的?MCF-7/ ADM細(xì)胞膜上P-g有明顯表達(dá)，加用DATS后有明顯的抑制作用。證明DATS可以通過抑制乳腺癌干細(xì)胞上P-gp蛋白表達(dá)而逆轉(zhuǎn)耐藥。NF-κB可以提高腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度下降而產(chǎn)生抗藥性[5]。也有研究證明，乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞中NF -κB可調(diào)控人MDR1啟動(dòng)子活性[6]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADM細(xì)胞中NF-κB高表達(dá)，但在使用DATS后表達(dá)減弱，聯(lián)合NF-κB抑制劑后，P-gp抑制不明顯。那么，可以考慮DATS的逆轉(zhuǎn)耐藥途徑是通過NF-κB從而抑制P-gp，使化療藥物再次起作用。

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【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【中圖分類號】R737.9