多藥耐藥相關蛋白2基因在COC1/DDP細胞對順鉑耐藥中的作用

張　珂，張　霞，孫彩萍，胡　濱

(鄭州大學第二附屬醫院婦產科，河南 鄭州 450014)

多藥耐藥相關蛋白2基因在COC1/DDP細胞對順鉑耐藥中的作用

張珂，張霞，孫彩萍，胡濱

(鄭州大學第二附屬醫院婦產科，河南 鄭州 450014)

[摘要]目的觀察順鉑耐藥卵巢癌細胞系COC1/DDP中多藥耐藥相關蛋白2(MRP2)基因的表達，探討其反義寡脫氧核苷酸(ASODN)對COC1/DDP順鉑耐藥的逆轉作用。方法設計合成針對MRP2的ASODN，以200 nmol·L-1濃度轉染COC1/DDP細胞，用四甲基偶氮唑藍法觀察順鉑對細胞抑制率的影響，逆轉錄PCR檢測MRP2基因表達水平的變化。結果COC1/DDP細胞中MRP2基因呈高表達，其mRNA相對表達值為0.420 0±0.050 0，而COC1細胞中無表達。與COC1/DDP組比較，MRP2-ASODN組MRP2基因低表達，mRNA相對表達值為0.018 7±0.023 0，耐藥指數降低為4.58，差異均有統計學意義(P<0.05)；SODN組MRP2表達及耐藥指數改變差異均無統計學意義(P>0.05)。結論MRP2基因高表達與COC1細胞獲得順鉑耐藥性有密切關系；MRP2-ASODN能有效逆轉COC1/DDP細胞對順鉑的耐藥性。

[關鍵詞]卵巢腫瘤；順鉑；反義寡核苷酸；多藥耐藥性

如何逆轉特別是在基因水平逆轉卵巢癌對順鉑耐藥是臨床醫生關注的熱點。反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)技術是指用一段人工合成的能與mRNA互補結合的DNA單鏈來抑制基因的表達。我們觀察了人多藥耐藥相關蛋白2(multi-drug resistance related protein-2，MRP2)基因在卵巢癌順鉑耐藥細胞株COC1/DDP與其親代細胞間表達的差異。并設計合成相應的ASODN抑制其表達，觀察細胞耐藥性的改變，為臨床逆轉順鉑耐藥提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料人卵巢癌細胞系COC1及順鉑耐藥卵巢癌細胞系COC1/DDP購自武漢大學中國典型培養物保藏中心；順鉑購自山東齊魯制藥廠；脂質體Oligofectamin購自美國Invitrogen 公司；抗人MRP2小鼠單克隆抗體購自深圳晶美公司；四甲基氮唑藍購自美國Sigma公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；第一鏈cDNA合成試劑盒購自深圳晶美公司；PCR反應試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2細胞中MRP2基因的表達使用逆轉錄PCR法測定(轉染前后細胞均行測定，所有研究至少重復3次)細胞中MRP2基因的表達。MRP2引物由上海博亞生物技術有限公司合成。MRP2(453 bp)上游引物序列 5’-GGAACAATTGTAGAGAAAGGATC-3’，下游引物序列 5’-CACAAACGCAACGATGATGAAGAA-3’；內參照β-actin(317 bp)上游引物序列 5’-GTGGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’；下游引物序列5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。

1.3細胞轉染針對MRP2的ASODN及錯義寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide，SODN)由北京賽百勝公司合成。其序列如下：MRP2-ASODN：3’-TCAGGTCCTTAGTACGA-5’；SODN: 5’-AGTAGGCTTGCCTGGCAG-3’。測定的細胞分為3組(MRP2-ASODN組、COC1/DDP組、SODN組)。參考脂質體Oligofectamin說明書制備脂質體寡核苷酸復合物后轉染COC1/DDP細胞，MRP2-ASODN及SODN濃度為200 nmol·L-1。每組復設4孔。

1.4細胞生長抑制率及耐藥指數測定接種3組細胞于96孔板，加入不同濃度的順鉑(0.5、1、2、2.5、5、10、20、40 μg·mL-1)20 mL，各濃度設3個平行孔，空白孔加入PBS。孵育48 h后每孔加入MTT(5 mg·mL-1)10 μL，孵育4 h，離心振蕩后測定吸光度A值。細胞存活率=實驗孔A值/對照孔A值×100%。細胞生長抑制率=(對照組平均吸光度A值-加藥組平均吸光度A值)/對照組平均吸光度A值×100%。半效抑制量(IC50)應用SPSS 13.0進行Probit回歸后求得。耐藥指數(RI)=耐藥細胞株IC50/敏感細胞株IC50。

1.5統計學處理采用SPSS 13.0分析數據，計量資料用±s表示，比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1細胞中MRP2基因的表達COC1細胞中MRP2基因呈陰性表達，COC1/DDP細胞中MRP2 mRNA相對表達值為0.420 0±0.050 0。COC1細胞IC50值為(0.79±0.06)μg·mL-1，COC1/DDP細胞為(5.62±0.13)μg·mL-1，RI為7.20。見圖1。

圖1　不同細胞中MRP2基因的表達

1:COC1中β-actin；2:COC1/DDP中β-actin；3:COC1中MRP2；4:COC1/DDP中MRP2

2.2轉染前后細胞中MRP2的mRNA表達的改變MRP2-ASODN組、SODN組MRP2 mRNA相對表達值分別為0.018 7±0.023 0(與COC1/DDP組的0.370 0±0.008 6比較差異有統計學意義，P<0.05)、0.398 5±0.033 1(與COC1/DDP組比較差異無統計學意義，P>0.05)。MRP2-ASODN組與SODN組比較差異有統計學意義(P<0.05)。轉染MRP2-ASODN能顯著降低COC1/DDP細胞中MRP2的表達。見圖2。

圖2　轉染前后細胞中MRP2的mRNA表達的改變

1:MRP2-ASODN組β-actin；2:SODN組β-actin；3:COC1/DDP組β-actin；4:MRP2-ASODN組MRP2；5:SODN組MRP2；6:COC1/DDP組MRP2

2.3轉染前后細胞耐藥性的改變與COC1/DDP組比較，MRP2-ASODN組的細胞IC50值下降了35.6%，為(3.62±0.29)μg·mL-1，RI為4.58(P<0.05)；SODN組的細胞IC50值略有降低，為(5.64±0.21)μg·mL-1，RI為7.14(P>0.05)。與SODN組比較，MRP2-ASODN組的細胞IC50值及RI均有明顯降低，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4轉染前后細胞抑制率的改變轉染相應基因的ASODN能顯著增加順鉑對耐藥細胞的抑制率。見圖3。

圖3　轉染前后細胞抑制率的改變

3討論

MRP2屬于ABC蛋白超家族[1]，是廣泛存在于細胞膜上的能量依賴性轉運蛋白，在細胞內主要負責轉運多種藥物以及陰離子化合物等物質。在腫瘤對順鉑耐藥的產生過程中，細胞內藥物聚集濃度的降低起著重要的作用[2]。研究[3]證明MRP2在體內具有轉運多種抗腫瘤藥物的功能。國內外對于MRP2是否導致腫瘤順鉑耐藥進行了大量的研究，但至今尚無定論。Materna 等[4]對卵巢癌、腎上腺皮質腫瘤以及黑色素瘤細胞的研究發現3種對順鉑耐藥的腫瘤細胞中MRP2均呈高表達狀態，其后針對MRP2基因設計了特異性核酶以封閉基因的表達，轉染后明顯降低了3種細胞的順鉑的耐藥性。曾曉勇等[5]對于膀胱癌的研究認為MRP2的表達與膀胱癌對順鉑的耐藥性并不相關。

ASODN屬于反義寡核苷酸技術的一種，利用體外合成的單鏈DNA分子通過與mRNA的特異性結合從而抑制目的基因的表達。St?ckel等[6]對MRP2基因的研究表明核苷酸序列-517和-197對MRP2的基礎表達是決定性的。本研究將MRP2-ASODN序列設計在該區間的成環區，BLAST同源分析與人MRP2基因高度同源，符合寡核苷酸的設計原則。

我們應用MRP2-ASODN轉染COC1/DDP細胞，顯著降低了該基因mRNA的表達，因此本研究所設計的ASODN可以特異性作用于靶基因，在轉錄水平抑制其表達。同時，本研究采用陽離子脂質體包裹ASODN提高了轉染效率。

本研究結果證實了MRP2在COC1/DDP細胞對順鉑耐藥產生中的作用，為應用反義寡核苷酸逆轉腫瘤耐藥提供了可能，并為尋找卵巢癌臨床有效的化療方案提供了參考。

參考文獻：

[1]Taniguchi K, Wada M, Kohno K, et al.A human canalicular multispecific organic anion transporter (cMOAT) gene is overexpressed in cisplatin-resistant human cancer cell lines with decreased drug accumulation[J].Cancer Res, 1996, 56(18):4124-4129.

[2]Siddik ZH.Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance[J].Oncogene,2003,22(47):7265-7279.

[3]Cui Y, K?nig J, Buchholz JK, et al.Drug resistance and ATP-dependent conjugate transport mediated by the apical multidrug resistance protein, MRP2, permanently expressed in human and canine cells[J].Mol Pharmacol, 1999,55(5):929-937.

[4]Materna V, Liedert B, Thomale J, et al.Protection of platinum-DNA adduct formation and reversal of cisplatin resistance by anti-MRP2 hammerhead ribozymes in human cancer cells[J].Int J Cancer, 2005,115(3):393-402.

[5]曾曉勇,楊為民,葉章群,等.γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和多藥耐藥相關蛋白基因在膀胱癌中的表達及相關性分析[J].華中科技大學學報:醫學版, 2002,31(6):649-652.

[6]St?ckel B, K?nig J, Nies AT, et al.Characterization of the 5’-flanking region of the human multidrug resistance protein 2 (MRP2) gene and its regulation in comparison withthe multidrug resistance protein 3 (MRP3) gene[J].Eur J Biochem, 2000, 267(5):1347-1358.

作者簡介：張珂(1979-)，女，碩士，主治醫師，主要從事婦科腫瘤的基礎與臨床研究。E-mail：kkxxzj@126.com 吳曉翠(1964-)，女，副主任醫師，主要從事腫瘤放療相關研究。E-mail：wangmamamm@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.05.001

[中圖分類號]R737.31；R730.53

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2015)05-0369-03

(收稿日期：2015-06-12)

基金項目：國家臨床重點專科建設項目

通信作者：孟輝(1973-)，女，博士，副主任醫師，主要從事腫瘤發生機制研究。E-mail：menghuidrch@163.com

Effect of Multi-drug Related Protein-2 in the
Cisplatin Resistance of COC1/DDP Cells

Zhang Ke, Zhang Xia, Sun Caiping, Hu Bin

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theSecond

AffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression of multi-drug resistance related protein-2 (MRP2) of COC1/DDP cell line, and the reversion of cisplatin resistance by antisense oligodeoxynucleotide (ASODN).MethodsThe ASODN targeting MRP2 was designed and synthesized.The ASODN targeting MRP2 with the concentration of 200 nmol·L-1was transferred into COC1/DDP cells by lipofectin.The inhibition rate of transferred cells to cisplatin was detected with MTT assay.The altered expression of MRP2 was detected by reverse transcription PCR.ResultsMRP2 were overexpressed in cisplatin resistant cell line of COC1/DDP compared with COC1 cell line.Compared with the COC1/DDP cell group, MRP2 expression in the MRP2-ASODN transfected cell group was significantly decreased to 0.018 7±0.023 0, and the resistance index was 4.58 (P<0.05); there were no difference in the MRP2 expression and resistance index between the COC1/DDP cell group and the SODN group (P>0.05).ConclusionThe overexpression of MRP2 may play an important role in the induction of resistance of COC1/DDP cells to cisplatin; MRP2-ASODN can effectively reverse the resistance of COC1/DDP cells to cisplatin and increase their drug sensitivity in a sequence specific manner.

[Key words]ovarian neoplasms; cisplatin; antisense oligodeoxynucleotide; multi-drug resistance