miR-125a靶向基因對肝癌細胞類胰島素生長因子-1及其受體抑制劑表達的影響

miR-125a靶向基因對肝癌細胞類胰島素生長因子-1及其受體抑制劑表達的影響

張日金

(安丘市人民醫院普外科，山東安丘262100)

摘要〔〕目的探討miR-125a靶向基因對肝癌細胞類胰島素生長因子(IGF)-1及其受體抑制劑鬼臼苦素(PPP)表達的影響。方法在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中接種Hep2細胞,當細胞融合度達到90%時，更換為乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和胰蛋白酶的消化液消化，使全部細胞完全脫離瓶壁，于培養瓶內,在孵箱中培養。構建為重組質粒pGenesil-miR-125a。轉染Hep2細胞。篩選建立穩定轉染的Hep2細胞，根據轉染質粒的不同分為對照組和實驗組，檢測miR-125a對腫瘤細胞抑制作用和IGF-1、PPP的水平。結果實驗組與對照組相比,活細胞數量明顯降低(P<0.05)。隨著細胞的增殖，兩組細胞的IGF-1陽性率均降低，與實驗組相比，對照組下降更為明顯(P<0.05)。對照組細胞PPP陽性率未發生明顯變化(P>0.05)，實驗組細胞PPP陽性率明顯升高(P<0.05)。結論miR-125a靶向基因能夠降低肝癌細胞類IGF-1水平，升高其受體抑制劑PPP的水平，抑制肝癌細胞的增殖。

關鍵詞〔〕miR-125a；肝癌細胞；胰島素樣生長因子；胰島素生長因子受體抑制劑

中圖分類號〔〕R735.7〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：張日金(1971-),男,副主任醫師，主要從事肝膽胰腺腫瘤研究。

肝癌致死率最高的癌癥之一，研究表明〔1〕，miRNA 參與了多種腫瘤的發生、發展和轉移。其中一些miRNA在肝癌中和正常組織中的表達存在差異，這是由于miRNA 影響了肝癌的增殖。還有研究指出miRNA 可以作為腫瘤新的靶點，用于腫瘤的診斷和治療〔2〕。有學者在研究肝癌 miRNA的文獻中指出，miR-125a在肝癌組織中為表達量降低，其過量的表達會誘導肝癌細胞的凋亡〔3〕，但是其在肝癌發生發展中的研究卻未見報道。本研究通過觀察肝癌模型小鼠肝功能胰島素樣生長因子(IGF)-1及其受體抑制劑鬼臼苦素(PPP)表達的影響，來探究miR-125a靶向基因對肝癌細胞的作用。

1資料與方法

1.1材料

1.1.1試劑1640完全培養基(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、二甲亞砜(DMSO)、羊抗兔、羊抗鼠二抗(SouthernBiotech 公司)、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.1.2細胞株和菌株人肝癌細胞株(HepG2)細胞由本院基礎醫學院藥理實驗室提供，人正常肝細胞株(HL7702)細胞購自中南大學湘雅醫學院細胞中心。

1.2方法

1.2.1細胞培養在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中接種Hep2細胞,置于培養箱中培養,細胞呈單層貼壁生長表示細胞生長良好。當細胞融合度達到90%時，更換為乙二胺四二酸(EDTA)溶液和胰蛋白酶的消化液消化，消化液與細胞充分接觸，室溫放置待細胞皺縮或已離開瓶壁呈游離狀態，加入完全培養液以終止消化。吹洗細胞生長面,使全部細胞完全脫離瓶壁。反復吹打使細胞完全分開。離心，棄上清，并調整細胞濃度，吸取一定量細胞于培養瓶內,在孵箱中培養。

1.2.2miR-125a 轉染的模型建立將miR-125a基因克隆至載體pGenesil-1質粒，構建為重組質粒pGenesil-miR-125a。經限制性內切酶來證實可在細胞內穩定表達，同時設計質粒對照組，并按照說明書用pGenesilmiR-125a及對照質粒轉染Hep2細胞。篩選建立穩定轉染的Hep2細胞，根據轉染質粒的不同分為對照組和實驗組。

1.3檢測指標及觀察方法

1.3.1miR-125a對腫瘤細胞抑制作用的檢測應用MTT法：將細胞收集到含胎牛血清的培養基中。離心使細胞沉積，加到培養基中重懸，計數細胞。將細胞稀釋，注意吹打，種于96孔板中，繼續培養細，在孔中加入20 μl MTT溫育4 h。加入DMSO，震蕩10 min，用酶標儀記錄OD值，繪制細胞生長曲線。

1.3.2IGF-1、PPP水平的檢測免疫組化法檢測 IGF-1、PPP的水平，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞，加入細胞裂解液裂解 30 min；完成后將細胞置于離心管中離心，用過氧化物酶阻斷酶的活性，PBS沖洗,用鏈霉菌素-生物素復合物(sABC)免疫組化試劑盒檢測IGF-1、PPP表達水平。Ⅰ抗分別為兔抗鼠IGF-1抗體及PPP5抗體,按試劑盒說明書操作。二氨基聯苯胺(DAB)顯色,脫水,透明,封片。于光鏡下觀察IGF-1、PPP陽性率。每張切片選取5個視野，計算平均陽性細胞率。

1.4統計學方法應用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2結果

2.1細胞增殖情況比較實驗組與對照組相比,活細胞數量明顯降低，實驗組細胞增殖情況：1、3、5、7 d OD值分別為1.36±0.28,2.58±1.17,3.01±1.34,3.54±1.50；對照組分別為1.43±0.39,2.26±0.99,3.74±1.15,5.58±1.82(P<0.05)。

2.2IGF-1、PPP水平比較隨著細胞的增殖，兩組細胞的IGF-1陽性率均降低(干預前實驗組為26.98±10.27，對照組為28.37±12.42；干預組后分別為20.17±12.38,16.18±15.14),與實驗組相比，對照組下降更為明顯(P<0.05)。對照組細胞PPP陽性率未發生明顯變化(干預前14.16±5.09，干預后16.37±12.19)(P>0.05)，實驗組細胞PPP陽性率明顯升高(干預前15.17±6.87，干預后25.17±9.27)(P<0.05)。

圖1　兩組細胞IGF-1比較

圖2　兩組細胞PPP陽性率比較

3討論

肝癌是世界第五大惡性腫瘤,全球每年新發病例數約 65 萬，死亡數約為 60 萬〔4〕，在中國是第二大惡性腫瘤。由于其起病隱匿，惡性程度高，病情發展迅速，其發病率幾乎等同于致死率，因此導致患者的生存期短，死亡率高。肝癌的發病機制是多因素、多步驟的復雜過程,其分子生物學機制還沒有完全闡明。miRNA 通過抑制 mRNA 的翻譯，從而在轉錄后沉默基因，對生物體的發育、分化、增殖等生理活動過程中進行精確調節〔5〕。有學者通過對microRNA 的表達芯片分析，發現了miR-125a在肝癌組織中低表達。因此miR-125a靶向基因對于肝癌的發生和發展具有一定的作用〔6〕。

IGF-1是一種重要生長刺激因子，由肝細胞合成和分泌。 IGF-1基因定位在染色體12,全長100 kb,編碼70氨基酸的單鏈蛋白多肽。IGF-1的表達主要受生長激素的調節。有研究表明〔7〕，IGF-1通過類胰島素樣作用，促進組織攝取葡萄糖，增加細胞對糖原和氨基酸的吸收，刺激糖酵解和糖異生進而促進脂肪和蛋白質的合成，其生物學活性主要受IGF-1受體及其結合蛋白(IGFBPs)的調節，在細胞的增殖、分裂及凋亡過程中發揮了重要作用。目前，IGF-1在肝癌中的作用仍存在一定爭議。有文獻報道〔8〕，IGF-1在乳腺癌、結腸癌、胰腺癌中都出現高表達，但在肝癌患者血清中的表達卻下降 。血清IGF-1水平升高在肝癌形成過程中發揮了重要作用〔9〕。PPP是IGF-1受體抑制劑，針對IGF-1酪氨酸激酶。PPP具有順式內酯環,因此其對微管蛋白無抑制作用,不影響ATP激酶和胰島素受體的活性,卻能抑制IGF- 1受體活性。與其他的 IGF-1R 抑制劑相比，PPP 具有更強的特異性，并且與胰島素受體有更小的交叉反應，有研究表明其對乳腺癌、肺癌、前列腺癌等有明顯的抑制作用〔10〕。也有研究證實PPP 對肝癌的作用，PPP 會誘導肝癌細胞發生凋亡〔11〕。會對肝癌細胞出現細胞皺縮、破碎，與周圍細胞脫離等情況，但PPP 對肝癌細胞的侵襲機制尚未完全闡明。實驗結果提示miR-125a可以升高PPP的水平從而促進肝癌細胞的凋亡，抑制其增殖。因此，總體來說，miR-125a靶向基因能夠降低肝癌細胞IGF-1水平，升高其受體抑制劑PPP的水平，抑制肝癌細胞的增殖，對臨床有指導意義。

4參考文獻

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11Liu C，Tang DG.MicroRNA regulation of cancer stem cells〔J〕.Cancer Res，2011；71(18):5950-4.

〔2014-11-27修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)