醫院檢出陰溝腸桿菌耐藥性及耐藥基因

醫院檢出陰溝腸桿菌耐藥性及耐藥基因

方先松1焦會園溫小云2宋礦余王力薇李蓉

(南昌大學基礎醫學院微生物學教研室，江西南昌330066)

摘要〔〕目的了解臨床分離陰溝腸桿菌耐藥性與耐藥基因情況，為臨床合理選用抗菌藥物提供理論依據。方法收集贛南醫學院第一附屬醫院臨床分離的陰溝腸桿菌40株，瓊脂稀釋法與紙片擴散法檢測常用抗菌藥物的敏感性，采用PCR方法對12種耐藥基因進行檢測。將該院檢出的40株陰溝腸桿菌作為研究樣本，采用瓊脂稀釋法與紙片擴散法行藥敏試驗，而后采用序列分析法與PCR(聚合酶反應)對12種耐藥相關基因進行分析。結果經分析后的藥物敏感結果顯示，40株陰溝腸桿菌標本對頭孢吡肟耐藥率以15.0%為最低，而對美羅培南與亞胺培南敏感率均為100%，其他抗菌耐藥率范圍為42.0%～92.5%；耐藥基因共8類，分別為sull、Int I 1、aac(3，')-I、AmpC、CTX-M-9、CTX-M-3、SHV-2a、TEM-1，sull+Int I 1為大部分菌株所攜帶；耐藥譜分為9型(A-I)，其中以A、D占比較高，且基因分型與其分型存在一定的相關性。結論陰溝腸桿菌有高度與多重耐藥性特征，其耐藥機制較為復雜且為多種耐藥機制共同作用。

關鍵詞〔〕醫院感染；陰溝腸桿菌；耐藥性；耐藥基因

中圖分類號〔〕〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：李蓉(1973-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事細菌耐藥與感染免疫的研究。

1贛南醫學院第一附屬醫院檢驗科

2贛南醫學院第一附屬醫院輸血科

第一作者：方先松(1981-)，男，副主任技師，主要從事生化免疫微生物方面研究。

陰溝腸桿菌為臨床上較為常見的致病菌，屬腸桿菌科，當前，隨著臨床廣譜抗菌藥物(如第三代與第四代碳青霉烯類、頭孢菌素類以及氟喹諾酮類藥物等)的不斷推廣與應用，陰溝腸桿菌耐藥現象日漸嚴重，為臨床疾病的治療帶來了難度〔1〕。本文對我院檢出的40株陰溝腸桿菌標本采用細菌藥敏試驗與分子生物學技術進行了基因檢測。

1資料與方法

1.1一般資料將我院2013年檢出的40株陰溝腸桿菌標本作為研究樣本。樣本來源：14份創傷創面分泌物，3份痰液，8份燒傷創面分泌物，6份靜脈血，6份潰瘍分泌物，膿液、竇道分泌物以及腦脊液各1份。菌種的鑒定采用VITEK-2 compact全自動微生物鑒定和藥敏分析儀，質控菌種為ATCC 27853與ATCC 25922。

1.2方法

1.2.1抗菌藥物敏感性檢測分離出40株陰溝腸桿菌采用K-B法(紙片擴散法)對抗菌藥物的敏感性進行測定，采用瓊脂稀釋法檢測抗菌藥物最低抑菌濃度MIC50、MIC90。結果判斷參照美國臨床實驗室標準化協會CLSIM100-S24(2014年)〔2〕，用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報告。藥敏紙片均為英國Oxoid公司生產，具體如下：阿莫西林(AMX)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)、替卡西林/克拉維酸(TIM)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢噻吩(CEF)、頭孢唑林(CFZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松(CRO)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢哌酮/舒巴坦(CFS)、頭孢西丁(FOX)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、妥布霉素(TOB)、阿米卡星(AMK)、左氧氟沙星(LVX)、復方磺胺甲口惡唑(SXT)、頭孢他啶/克拉維酸(CDO2)、頭孢噻肟/克拉維酸(CDO3)。

1.2.2耐藥基因檢測耐藥基因采用聚合酶鏈反應(PCR)〔3〕進行檢測，即先以煮沸法制備DNA擴增模板，耐藥基因共12種，其中β-內酰胺酶基因8種：blaSHV-2a、blaTEM-1、blaCTX-M-9、blaCTX-M-3、blaCTX-M-2、AmpC、PRE-1、VEB-1；氨基糖苷類修飾酶基因(AMEs)2種：aac(3，')-I、aac(6，')-I；磺胺耐藥相關基因(sull)與Ⅰ類整合酶基因(Int I 1)各1種。上述引物均以已發布的各型基因序列設計；將純水作為陰性對照；擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，并于紫外凝膠成像儀下做好觀察與記錄。

1.3序列測定與分析當擴增陽性基因PCR產物經純化作用后，采用雙脫氧末端終止法進行測定，結果在PUBMED的BLAST程序中行同源性分析。

2結果

2.1藥敏試驗結果情況40株陰溝腸桿菌標本對FEP耐藥率以15.0%為最低，而對MEM、IPM敏感率均為100%，其他抗菌耐藥率范圍為42.0%～92.5%，見表1。

2.2耐藥譜分型情況40株菌株中共檢出基因為8種，其耐藥譜分為9型(A-I)，其中以A、D占比較高，且基因分型與其分型存在一定的相關性，見表2。

2.3基因檢測結果情況經基因檢測后的結果顯示，基因分型及其同源菌株情況見表3。

表1　藥敏試驗結果情況

中介視為耐藥

表2　耐藥譜分型情況

R表示耐藥；S表示敏感

表3　基因檢測結果情況

2.4本次序列分析情況超廣譜β-內酰胺酶基因CTX-M-3組取33號與2號菌株測序列，均為亞型；SHV-2a組取25、21、16、8號菌株進行測試，均為SHV-2a；AmpC組取18、12、10、5號菌株進行測序，其與AmpC酶核苷酸序列(AF411149)99%同源；TEM-1組則取37--27、21、13、3號菌株進行測序，結果均為TEM-1亞型；sull組取5、4、3、2號菌株測序，結果均為sull；aac(3，')-I組取40、33、32、14號菌株進行測序，結果均為aac(3，')-I。圖1為本次序列基因PCR擴增電泳示意圖。

M：DNA Marker DL 2000，1～19；陰溝腸桿菌；+：陽性對照；-：陰性對照 圖1　本次序列基因PCR擴增電泳示意圖

3討論

陰溝腸桿菌在醫院感染中較為常見，當前，隨著多重耐藥現象的日漸加重，臨床上常用的抗菌藥物耐藥率呈現出不斷提高態勢〔3，4〕。本研究認為臨床上針對產AmpC酶陰溝腸桿菌者可給予其FEP，而IPM等碳青霉烯類抗生素對所分離出的陰溝腸桿菌的抗菌活性較高，可有效發現耐藥株，因而廣泛耐藥重癥感染者治療過程中可將其作為首選治療藥物，但應注意慎重使用，避免篩選或誘導出可耐藥菌株，進而防止其出現播散，對治療造成惡劣影響〔5〕。

陰溝腸桿菌對β-內酰胺類抗生素的主要耐藥機制為產β-內酰胺酶，其中以ESBLs、AmpC酶以及MBL(碳青霉烯酶)最為常見。本研究中，12種β-內酰胺酶基因中有5種出現了擴增陽性，分別為blaSHV-2a、blaTEM-1、blaCTX-M-9、blaCTX-M-3、AmpC酶基因，且僅研究后的結果顯示，blaTEM基因具有相當高攜帶率，占比為45%，測序后的結果顯示其為TEM-1亞型；blaSHV基因攜帶率為30.0%，測序后的結果顯示其為SHV-2a；AmpC酶基因檢出率為35.0%；blaCTX-M-9基因攜帶率為5.0%，

期間見4株產AmpC酶與ESBLs酶菌，產SHV與TEM基因10株，且當均菌株中的SHV與TEM型ESBLs同時存在或AmpC酶與ESBLs同時表達時，耐藥表型便會較為復雜，因而可加大治療難度〔6〕。經檢測后的結果顯示，陰溝腸桿菌之所以對第三代頭孢菌素耐藥，其主要與AmpC酶與ESBLs型β-內酰胺酶有關，本研究表明陰溝腸桿菌中的β-內酰胺類抗生素耐藥相關基因類型存在較大的差別。近年來，細菌移動性遺傳元件發現，Ⅰ類整合子耐藥基因盒中攜帶的二氫葉酸合成酶編碼基因Sull陽性提示對磺胺類藥物可耐受〔7〕，本研究中，Sull基因陽性率為90.0%，磺胺耐藥基因檢出率或與人們過多使用消毒劑，進而推動了細菌耐消毒劑基因進程，導致院內感染，而其基因同源菌株的存在，則在很大程度上表明其感染流行的可能性較小〔8〕。

綜上所述，陰溝腸桿菌有高度與多重耐藥性特征，其耐藥機制較為復雜且為多種耐藥機制共同作用，與耐藥特征復雜、耐藥譜廣存在較大的關聯，故而我們應采取相應的措施以降低醫源性感染的發生，并做好細菌培養與藥敏試驗工作，聯合做好醫院感染監測工作，以降低陰溝腸桿菌醫院感染率。

4參考文獻

1王鳳霞.臨床感染患者陰溝腸桿菌對抗菌藥物敏感性分析及其耐藥機制研究〔J〕.天津醫科大學學報，2012；10(2)：1023-4.

2劉明家，周志強，祖元剛，等.濕法消解-火焰原子吸收法測定動物樣品中六種金屬元素〔J〕.光譜學與光譜分析，2012；32(7)：1961-4.

3王萍，張和平，薛克儉，等.127株陰溝腸桿菌耐藥性監測分析〔J〕.國際檢驗醫學雜志，2013；34(24)：3362-2，3364.

4鮑連生，艾洪武，虞濤，等.兒童陰溝腸桿菌感染臨床分布及耐藥性變遷〔J〕.中華醫院感染學雜志，2012；22(13)：2923-5.

5李智偉，向陽，趙輝，等.1175株陰溝腸桿菌耐藥性變遷特點〔J〕.新疆醫科大學學報，2012；35(10)：1379-82.

6李美，劉寶，萬珊，等.2008-2012年臨床分離陰溝腸桿菌的分布及耐藥性分析〔J〕.中國抗生素雜志，2014；39(10)：775-9.

7Zhao YX，Juan J，Wong H，etal.The sewer enterobacteriaceae produce ultra broad spectrum beta lactamase genotype analysis〔J〕.J Pediat Clin Pract Mag，2012；27(12)：956-7.

8Wang YC，Zheng GY,Yang J,etal.Lower respiratory tract infections sewer enterobacter pop and resistance analysis〔J〕.China Lab Dia，2012;(4)：628-30.

〔2014-10-22修回〕

(編輯李相軍)

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