α-硫辛酸對戊四氮點燃大鼠認知功能的保護作用及機制探討

趙冉冉，徐曉臣，檀國軍，王維平*，張文忠，劉吉祥

（1.河北省邯鄲市第一醫院急診科，河北邯鄲056002;2.河北醫科大學第二醫院神經內科，河北石家莊050000; 3.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北邯鄲056002;4.河北邯鄲市第一醫院神經外科，河北邯鄲056002）

α-硫辛酸對戊四氮點燃大鼠認知功能的保護作用及機制探討

趙冉冉1，2，徐曉臣3，檀國軍2，王維平2*，張文忠1，劉吉祥4

（1.河北省邯鄲市第一醫院急診科，河北邯鄲056002;2.河北醫科大學第二醫院神經內科，河北石家莊050000; 3.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北邯鄲056002;4.河北邯鄲市第一醫院神經外科，河北邯鄲056002）

目的 觀察α－硫辛酸（alpha－lipoic acid，ALA）對戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）點燃大鼠認知功能的保護作用，并探討其機制。方法 選取36只健康成年雄性SD大鼠隨機分為對照組、癲癇組和治療組，每組12只。癲癇組和治療組給予PTZ隔日腹腔注射建立PTZ點燃模型，治療組同時給予ALA腹腔注射，利用Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）檢測動物空間學習、記憶能力，采用分光光度法檢測海馬組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH），2＇，7＇－二氯熒光素二乙酸酯（2＇，7＇－dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH－DA）探針檢測腦組織中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的變化。結果 隨著水迷宮訓練進行，各組大鼠逃避潛伏期呈逐漸下降趨勢，但癲癇組逃避潛伏期時間下降幅度最小，治療組逃避潛伏期下降幅度較癲癇組更明顯。癲癇組在目標象限停留時間顯著縮短，海馬組織中MDA和ROS明顯增高，GSH含量明顯降低（P＜0.05）;治療組與癲癇組相比，目標象限停留時間明顯延長，海馬組織中ROS和MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高（P＜0.05）。結論 氧化應激在癲癇中有非常重要的作用，ALA抗氧化治療能夠減輕腦組織中氧化應激損傷，改善癲癇大鼠的認知功能，為癲癇的治療提供了新的思路。

癲癇;戊四唑;硫辛酸;認知

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和模型制備 健康雄性SD大鼠36只，體質量250～290 g，河北省實驗動物中心提供，按照隨機數字表法分為對照組、癲癇組和治療組，每組 12只;對照組每日腹腔注射生理鹽水1 mL/kg，癲癇組和治療組給予 PTZ腹腔注射35 mg/kg，1次/d，共30 d。依據Racine分級標準［5］觀察大鼠癇樣發作的等級。30 d后，治療組大鼠每天給予ALA 50 mg/kg腹腔注射，癲癇組給予等量生理鹽水腹腔注射，共給予14 d。

1.2 Morris水迷宮試驗 于實驗后第45天起行Morris水迷宮試驗，第45～49天為定位航行試驗，可測試大鼠的學習能力，每天按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序分別設定4個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠從入水起至爬上平臺所花費的時間為逃避潛伏期，120 s后仍未找到平臺的將逃避潛伏期記錄為120 s，并將大鼠引上平臺停留30 s，間隔20 min后將大鼠從下一個象限入水點放入水中并記錄逃避潛伏期，取4次不同象限的逃避潛伏期平均值為當日的逃避潛伏期值。第50天為空間探索試驗，可檢測大鼠的記憶能力，將平臺撤去，記錄大鼠2 min內為搜索平臺、停留在平臺所在象限的時間（目標象限停留時間）。

1.3 活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）檢測 Morris水迷宮試驗結束后每組大鼠各取6只，麻醉后斷頭取腦，冰盤上快速分離海馬，用眼科剪將海馬組織剪碎，輕輕研磨組織后經300目篩網過濾，制備單細胞懸液，然后在室溫下4 000 r/min離心3 min，棄上清后加入二氯二氫熒光素－乙酰乙酸酯（2＇，7＇－dichlorofluorescin diacetate，DCFH－DA）工作液，37℃避光孵育20 min后應用FACS AriaⅡ流式細胞儀，每個樣本收集104個細胞，以DCF的熒光強度作為ROS含量值。

1.4 丙二醛（malondialdehyde，MDA）和還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測 Morris水迷宮試驗結束后每組各取6只大鼠，麻醉后斷頭取腦，冰盤上快速分離取海馬，液氮速凍后－80℃保存，用于檢測MDA和GSH含量，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，分別采用重復測量設計資料的方差分析、單因素方差分析和q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 癇樣發作情況 大鼠注射PTZ后于第5天起出現凝視、反復洗臉、點頭樣動作，癥狀逐漸加重，最終出現全身強直－陣攣樣發作。停止PTZ注射后未再出現癲癇發作，對照組無癲癇發作。

2.2 大鼠學習記憶能力的改變 Morris水迷宮結果提示，隨著水迷宮訓練進行，各組大鼠逃避潛伏期呈逐漸下降趨勢，但癲癇組逃避潛伏期時間下降幅度最小，各組在組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統計學意義（P＜0.01）。各組間目標象限停留時間差異有統計學意義（P＜0.01）。兩兩比較后發現，癲癇組大鼠逃避潛伏期較對照組明顯延長（P＜0.05），目標象限停留時間較對照組明顯縮短（P＜0.05）;治療組大鼠與癲癇組相比逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），目標象限停留時間明顯延長（P＜0.05）。見表1。

表1 α-硫辛酸對Morris水迷宮表現的影響Table 1 Effects of ALA on Morris water maze performance （n=6，±s，s）

表1 α-硫辛酸對Morris水迷宮表現的影響Table 1 Effects of ALA on Morris water maze performance （n=6，±s，s）

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.05與癲癇組比較（q檢驗）

目標象限逃避潛伏期組別停留時間對照組 65.13±7.21 53.26±4.32 33.68±3.11 18.16±1.6 45 d 46 d 47 d 48 d 49 d 0 7.50±0.38 40.11±4.01癲癇組 69.66±6.56 59.41±4.12 46.17±3.47 39.61±3.21 29.56±2.25 15.31±0.98*治療組 64.11±5.86 54.61±5.76 39.71±3.31 21.36±1.67 11.01±1.03 28.12±1.36#＜0.01組間時點間組間·時點間F=77.913 P＜0.01F=729.411 P＜0.01F=20.791 P＜0.01F=55.812P

2.3 大鼠海馬組織中氧化應激參數的改變 癲癇組大鼠海馬組織中ROS和MDA的含量較對照組明顯升高（P＜0.05）;治療組較癲癇組顯著下降（P＜0.05），但仍明顯高于對照組（P＜0.05）。癲癇組大鼠海馬組織中GSH的含量較對照組明顯下降（P＜0.05）;治療組較癲癇組明顯增加（P＜0.05），但仍低于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 α-硫辛酸對海馬組織中ROS、MDA和GSH水平的影響Table 1 Effects of ALA on levels of ROS，MDA and GSH in the hippocam pus （n=6，±s）

表2 α-硫辛酸對海馬組織中ROS、MDA和GSH水平的影響Table 1 Effects of ALA on levels of ROS，MDA and GSH in the hippocam pus （n=6，±s）

*P＜0.05與對照組比較 #P＜0.05與癲癇組比較（q檢驗）

組別 ROS MDA（nmol/mg） GSH（mg/g） 1.00±0.09 7.31±0.61 46.89±4.32癲癇組 3.01±0.22* 22.76±2.11* 20.32±1.98*治療組 1.91±0.12*# 13.34±1.07*# 34.96±3.23*#F對照組0.001 0.001 0.001 433.187 130.319 101.201P

3 討 論

氧化應激指體內氧化和抗氧化系統失衡，使機體內ROS生成過多或消除減少，體內過多的ROS參與了脂質過氧化和DNA的損傷，從而導致細胞功能受損。在多種癲癇動物模型腦組織中均存在有腦內MDA升高、GSH耗竭、DNA損傷及各種亞細胞器結構破壞［6］，尤其是造成線粒體的損傷，線粒體損傷后出現細胞功能障礙，導致離子交換異常，繼而出現海馬硬化、神經元數量的減少、膠質細胞活化等癲癇特征性病理改變。提示氧化應激在癲癇的發生發展中起到了重要的作用［7］。既往的動物研究中發現，通過降低氧化應激損傷的程度，能夠明顯降低癲癇大鼠的癇性發作等級，證實抗氧化藥物可能是治療癲癇的新的途徑［8］。PTZ點燃模型是用亞抽搐劑量的PTZ重復進行腹腔注射，導致大鼠癇性發作等級逐漸升高直至大發作，PTZ點燃模型模擬了人類癲癇的特征，具有反復發作的特點，大鼠PTZ點燃模型同時具有認知功能障礙，是篩選治療癲癇藥物的理想模型。本研究結果顯示，PTZ點燃癲癇模型大鼠腦內ROS水平升高，MDA升高，GSH下降，存在氧化應激損傷。證實氧化應激在癲癇中起重要作用，為臨床應用抗氧化治療提供了實驗依據。

ALA具有獨特雙硫鍵的抗氧化分子結構，為天然強效抗氧化劑，ALA進入細胞后轉化為還原型二氫硫辛酸，抗氧化能力進一步增強［9］。ALA在抗氧化及糖代謝等方面的作用已引起高度關注，作為神經保護劑應用于糖尿病多發周圍神經病等多種神經系統疾病的治療，具有給藥方便、依從性好、安全性高的優勢。在多發性硬化［10］、腦卒中［11］、阿爾茨海默病［12］的動物模型中，均發現ALA具有神經保護和治療作用。除了抗氧化能力之外，ALA還能夠改善中樞膽堿能系統功能，增加腦內乙酰膽堿水平，保護認知功能［9］。本研究結果顯示，PTZ點燃癲癇模型大鼠癇性發作等級逐漸升高，癲癇模型成功建立，Morris水迷宮試驗提示癲癇大鼠伴有認知功能損害，ALA顯著改善了大鼠的空間學習和記憶能力。這可能是通過降低腦內ROS水平和脂質過氧化標記物MDA含量、提高具有抗氧化能力的GSH水平等抗氧化應激機制實現的。抗氧化策略有可能成為治療癲癇中認知功能障礙的新途徑。

［1］ Mefford HC.Thinking about cognition and epilepsy［J］.Epilepsy Behav，2014，41：276.

［2］ 應小明，金安，葉輝，等.抗癲癇藥對癲癇兒童認知功能的影響［J］.河北醫科大學學報，2011，32（5）：530－532.

［3］ Azam F，Prasad MV，Thanqavel N.Targeting oxidative stress component in the therapeutics of epilepsy［J］.Curr Top Med Chem，2012，12（9）：994－1007.

［4］ Gan X，Wu L，Huang S，etal.Oxidative stress－mediated activation of extracellular signal－regulated kinase contributes to mild cognitive impairment－related mitochondrial dysfunction［J］.Free Radic Biol Med，2014，75：230－240.

［5］ Zhao RR，Xu XC，Xu F，et al.Metformin protects against seizures，learning and memory impairments and oxidative damage induced by pentylenetrazole－induced kind ling in mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，448（4）：414－417.

［6］ Tchekalarova J，Ivanova N，Pechlivanova D，et al.Straindependent effects of sub－chronically infused losartan against kainic acid－induced seizures，oxidative stress，and heat shock protein 72 expression［J］.Cell Mol Neurobiol，2014，34（1）：133－142.

［7］ Martinc B，Grabnar I，Vovk T.The role of reactive species in epileptogenesis and influence of antiepileptic drug therapy on oxidative stress［J］.Curr Neuropharmacol，2012，10（4）：328－343.

［8］ Kaur H，Bal A，Sandhir R.Curcumin supplementation improves mitochondrial and behavioral deficits in experimental model of chronic epilepsy［J］.Pharmacol Biochem Behav，2014，125：55－64.

［9］ Villasana LE，Rosenthal RA，Doctrow SR，et al.Effects of alphalipoic acid on associative and spatial memory of sham－irradiated and 56Fe－irradiated C57BL/6J male mice［J］.Pharmacol Biochem Behav，2013，103（3）：487－493.

［10］ Khalili M，Azimi A，Izadi V，et al.Does lipoic acid consumption affect the cytokine profile in multiple sclerosis patients：a doubleblind placebo－controlled，randomized clinical trial［J］.Neuroimmunomodulation，2014，21（6）：291－296.

［11］ Connell BJ，Saleh M，Khan BV，et al.Lipoic acid protects against reperfusion injury in the early stages of cerebral ischemia［J］.Brain Res，2011，1375：128－136.

［12］ Sancheti H，Patil I，Kanamori K，et al.Hypermetabolic state in the 7－month－old triple transgenic mousemodel of Alzheimer＇s disease and the effectof lipoic acid：a13C－NMR study［J］.JCereb Blood Flow Metab，2014，34（11）：1749－1760.

（本文編輯：趙麗潔）

Protective effect of alpha-lipoic acid on cognitive impairment induced by pentylenetrazole-induced kindling in rats

ZHAO Ran－ran1，2，XU Xiao－chen3，TAN Guo－jun2，WANG Wei－ping2*，ZHANG Wen－zhong1，LIU Ji－xiang4
（ 1． Department of Emergency，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China; 2． Department of Neurology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，050000，China; 3． Department of Neurology，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China; 4． Department of Neurosurgery，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China）

Objective To explore the protective effect of alpha－lipoic acid（ALA）on cognitive function in an epilepsy model by pentylenetetrazole（PTZ）－kindling and the mechanism.MethodsThe healthy adult male 36 SD rats were randomly assigned into three groups：control group，PTZ group，and drug therapy group（12 rats，each group）.PTZ and drug therapy groups were injected intraperitoneally with PTZ to establish PTZ－kindling model.ALA was injected intraperitoneally in the drug therapy group.Morris water maze was used to evaluate spacial learning and memory function.Spectrophotometry was used to detect the levels of malondialdehyde and glutathione，2＇，7＇－dichlorodihydrofluoresce in diacetate probewas used to detect the level of reactive oxygen species in the hippocampi of the rats.ResultsIn the Morris water maze，all animals showed a progressive decline in the escape latency with training.The rats in PTZ group exhibited a significant prolongation of escape latency.In PTZ group，the escape latency was significantly prolonged（P＜0.05）and time spent in the target quadrant was shortened（P＜0.05），ROS and MDA significantly increased（P＜0.05），but GSH significantly decreased（P＜0.05）.However，administration of ALA significantly improved the performance in MWM，and decreased the contents of ROS and MDA，increased the level of GSH.ConclusionOxidative stress plays an important role in the pathogenesis of epilepsy，ALA can effectively protect cognitive function and ameliorate oxidative damage，which provides a new way for treating cognitive impairment induced by epilepsy.

epilepsy;pentylenetetrazole;thioctic acid;cognition癲癇是常見的神經系統疾病，以發作性、重復性、刻板性發作為特征，可導致嚴重的神經結構和功能改變，損害患者的認知功能，給患者和家庭帶來沉重的負擔。一次癇性發作是短暫的，而癲癇帶來的認知功能損傷則是長期存在的，且隨著病情的加重而不斷惡化，帶來比癇性發作更加嚴重的后果［1］。現有的大多數抗癲癇藥物不僅沒有改善認知功能，反而進一步損傷認知功能［2］，因此尋找能夠改善癲癇認知功能的藥物已迫在眉睫。癲癇的發病機制還未完全闡明，近年來認為氧化應激在癲癇的發生發展中具有重要的作用［3］，與此同時，研究發現氧化應激損傷與認知障礙也有密切聯系［4］。抗氧化策略有可能是改善癲癇認知功能的有效方法。α－硫辛酸（alpha－lipoic acid，ALA）是一種兼具脂溶性和水溶性的天然強效抗氧化劑，在臨床上用于治療糖尿病周圍神經病變，對多發性硬化、缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病等疾病有顯著的保護作用。ALA對于癲癇的認知障礙是否具有保護作用還未見報道。本研究觀察ALA對戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）點燃大鼠認知功能的保護作用，旨在為癲癇認知功能的改善提供新的思路。

R742.1

A

1007－3205（2015）03－0257－04

2014－11－05;

2014－12－10

河北省醫學科學研究重點課題計劃（20090371）;河北省科學技術研究與發展指導計劃項目（11276425）

趙冉冉（1983－），女，河北邯鄲人，河北省邯鄲市第一醫院主治醫師，醫學博士研究生，從事癲癇和認知研究。

*通訊作者。E－mail：a34251900@163.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.003