地塞米松對大鼠W alker 256乳腺癌骨轉移癌痛的作用

張 凡，李 毅，丁 杰，張海林

（河北醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，河北石家莊050017）

地塞米松對大鼠W alker 256乳腺癌骨轉移癌痛的作用

張 凡，李 毅，丁 杰，張海林*

（河北醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，河北石家莊050017）

目的 建立大鼠Walker 256乳腺癌骨轉移癌痛模型，觀察地塞米松對骨轉移癌疼痛痛閾的影響。方法 制備Walker 256乳腺癌細胞的大鼠腹腔積液瘤細胞，將其注射入大鼠脛骨，測量術前及術后機械刺痛閾和輻射熱痛閾。結果 接種Walker 256乳腺癌大鼠術側機械刺激痛覺和輻射熱痛覺閾值顯著降低，且病理學結果顯示骨質受到腫瘤破壞，提示Walker 256大鼠乳腺癌骨轉移癌疼痛模型成功建立。地塞米松（5 mg/kg）能夠顯著提高骨轉移癌疼痛模型刺痛痛閾。結論 地塞米松能夠緩解大鼠骨轉移癌疼痛。

腫瘤;地塞米松;疼痛測定

骨轉移是癌癥的常見并發癥之一，骨轉移瘤疼痛是癌癥轉移患者最常見的疼痛類型，約2/3骨轉移患者經歷重度疼痛［1］。隨著腫瘤治療的進步，帶瘤生存的患者越來越多，生存時間也越來越長，骨轉移瘤造成的并發癥日漸增多，骨轉移瘤疼痛已成為影響其生活質量的一個嚴重問題，已成為當前惡性腫瘤治療的一個難點［2］。不同于了解較為深入的神經病理性疼痛和炎性疼痛，骨轉移瘤疼痛并未得到廣泛研究。直到近幾年，合并疼痛研究和腫瘤研究的良好的骨轉移瘤疼痛動物模型才得以建立，提供了對骨轉移瘤疼痛實驗研究的平臺［3］。到目前為止，人們對骨轉移瘤疼痛的分子機制仍缺乏系統而深入的認識，臨床上有效治療骨轉移瘤疼痛的藥物十分有限，故對骨轉移瘤疼痛治療的研究顯得尤為重要［4］。地塞米松是一種腎上腺皮質激素類藥。具有抗炎、抗過敏、抗風濕、免疫抑制作用，臨床使用較廣泛［5］。有報道地塞米松治療對晚期腫瘤患者生活質量取得一定的效果，可明顯緩解晚期腫瘤患者食欲不振、惡心嘔吐、焦慮、疲倦乏力、心悸自汗等癥狀［6］。此外，應用地塞米松或聯合其他鎮痛藥物，能夠有效改善癌性疼痛［7］。本研究成功建立大鼠Walker 256乳腺癌骨轉移癌痛模型，觀察地塞米松對骨轉移瘤疼痛痛閾的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 Walker 256乳腺癌細胞株，購自北納創聯生物技術研究院。Wistar雌性大鼠48只（體質量180～200 g），Wistar幼年雌性大鼠2只（體質量80 g）。均由河北省實驗動物中心提供。地塞米松購自Sigma公司。

1.2 制備Walker256乳腺癌細胞的大鼠腹腔積液瘤細胞［8］將Walker 256大鼠乳腺癌細胞置于離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加漢克斯平衡鹽（Hank balance salt solution，HBSS）緩沖液重復漂洗1次。用細胞計數板進行計數，加適量HBSS緩沖液，調整細胞密度為2×107個/mL。選體質量80 g左右的Wistar幼年雌性大鼠，抽取0.2～0.3 m L腫瘤細胞接種幼鼠腹腔中。6～7 d后，待幼鼠出現腹腔積液癥狀，腹部明顯膨大時，抽取含腫瘤細胞的腹腔積液。1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，用HBSS緩沖液將細胞重懸，再以1 500 r/min離心5 min。然后用HBSS緩沖液調整細胞濃度為4× 107/mL，以備腫瘤接種時使用。

1.3 大鼠Walker256乳腺癌骨轉移癌痛模型［8］

1.3.1 動物分組 結果2.1部分實驗動物分組：將24只雌性Wistar大鼠（體質量180～200 g）隨機分成3組各8只，分別為空白對照組（該組大鼠不做任何手術處理）、假手術組（該組大鼠在脛骨處注入5μL HBSS緩沖液）、手術組（該組大鼠在脛骨處植入5μL Walker 256細胞），造模時間持續28 d。結果2.2部分實驗動物分組：將24只雌性Wistar大鼠（體質量180～200 g）隨機分成3組各8只，分別為假手術組（該組大鼠在脛骨處注入5μL HBSS緩沖液）、手術組（該組大鼠在脛骨處植入5μL Walker 256細胞）、手術+地塞米松組（該組大鼠在脛骨處植入5μLWalker 256細胞），大鼠出現疼痛行為預示造模成功，第17天開始每天腹腔注射地塞米松5 mg/kg至第26天。

1.3.2 制備大鼠脛骨癌痛模型 參照文獻報道［8］的方法并加以改進，制作大鼠脛骨癌痛模型。用1.0%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，手術組、假手術組動物采用仰臥位，用75%酒精對右側后肢進行消毒，去毛。在脛骨上段切開皮膚約1 cm，用鑷子鈍性分離肌肉，小心暴露脛骨骨面，用電動鉆孔器垂直于骨面鉆孔，至有明顯落空感后停止鉆孔，用10μL微量注射器抽取Walker 256細胞懸浮液5μL，緩慢植入至骨髓腔中，拔出微量注射器，然后迅速用無菌骨蠟封住鉆孔。如果有細胞懸浮液溢出，用75%酒精進行消毒，殺死溢出的癌細胞。逐層縫合切口，然后涂抹適量碘酒，以防切口感染。假手術組動物注射等體積HBSS溶液，其余操作同手術組。對照組大鼠不進行任何手術操作。

1.4 機械刺痛閾值測量 應用標準尼龍絲（美國North Coat Medical公司）刺激大鼠右后爪拓面。尼龍絲測試從最細柔開始逐漸順序增大標號，直到引發大鼠右后腿抬起所使用尼龍絲的標號即為機械痛閾值。閾值標準以g為計量單位。結果2.1部分實驗測量手術前和手術后第1、3、5、7、9、13、16、19、22、25、28天大鼠機械痛閾值。結果2.2部分實驗測量手術前和手術后第1、3、6、9、12、15、20、23、26天大鼠機械痛閾值。

1.5 熱痛閾值測量 應用激光熱源燈（PL－200熱痛儀，成都泰盟科技有限公司）照射大鼠右后爪拓面測量熱痛閾值。激光熱源強度為（25.0±0.1）℃。引發大鼠右后腿抬起所照射時間即為熱痛閾值。閾值標準以s為計量單位。結果2.1部分實驗測量手術前和手術后第1、3、5、7、9、13、16、19、22、25、28天大鼠熱痛閾值。

1.6 病理組織學觀察 于腫瘤細胞接種后28 d，斷頸法處死大鼠，直接取大鼠新鮮脛骨，盡量除去肌肉組織，立即放入4%多聚甲醛中固定3 d，然后置于甲酸多聚甲醛溶液（甲酸與4%多聚甲醛比例為3∶7）中脫鈣12～24 h，經脫水、透明、透蠟、包埋、切片后制成石蠟切片，然后進行HE染色。在顯微鏡下觀察腫瘤細胞生長及骨組織的破壞情況。

1.7 統計學方法 應用Origin 7.5軟件進行分析，計量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析、q檢驗和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠脛骨植入Walker 256乳腺癌細胞誘發骨轉移疼痛的變化

2.1.1 脛骨植入Walker 256乳腺癌細胞的大鼠機械刺激和輻射熱痛覺閾值 空白對照組和假手術組機械刺激痛覺閾值在手術后各時間點差異無統計學意義（P＞0.05）;手術組的大鼠于術后第7天，機械刺痛閾值開始逐漸降低，至第16天時機械刺痛閾值達到較低值（P＜0.05）（圖1A）。在相同時間點，空白對照組和假手術組的輻射熱痛覺閾值差異無統計學意義（P＞0.05）;而植入Walker 256細胞組大鼠，于術后第7天開始其輻射熱痛覺閾值逐漸降低，持續至第28天時達到最低值（P＜0.05）（圖1B）。

2.1.2 植入腫瘤細胞所致脛骨組織病理學變化于造模28 d，取各組大鼠脛骨，制備組織切片。在空白對照組（圖2A）和假手術組（圖2B），可見正常骨髓組織，未見其他骨結構改變。而手術組（圖2C）的脛骨切片展示，在原有宿主骨周圍出現多量新生骨，有的在一側，有的包繞;髓腔內可見腫瘤細胞，大部分伴有壞死，符合腫瘤表現。大鼠Walker 256乳腺癌骨轉移疼痛模型成功建立。

圖1 Walker256乳腺癌骨轉移瘤痛模型大鼠機械刺痛A.機械刺痛閾值;B.熱痛閾值*P＜0.05與對照組、假手術組比較（q檢驗）Figure 1 The withdrawal threshold to mechanical stimulus and withdrawal time in response to radiant thermal stimulus were reduced in rat model of bone cancer pain induced by Walker 256 mammary gland carcinoma cell

2.2 地塞米松對大鼠乳腺癌骨轉移疼痛模型機械刺痛痛閾的影響 乳腺癌骨轉移模型大鼠于術后機械刺痛閾值逐漸降低。于術后第17天起，連續腹腔注射給予5 mg/kg地塞米松;第20天后即顯著提高大鼠機械刺痛痛閾，持續至第26天（圖3）。

圖3 地塞米松提高大鼠Walker 256乳腺癌骨轉移疼痛模型機械刺痛閾值*P＜0.05與手術組比較（t檢驗）Figure 3 Dexamethasone elevated withdrawal threshold to mechanical stimulus in rat model of bone metastasis pain induced by Walker 256mammary gland carcinoma cells

3 討 論

骨轉移瘤疼痛是癌癥患者最常見的一種疼痛，也是腫瘤發生骨轉移時最常見的癥狀之一，利用合適的動物模型研究骨轉移癌疼痛的發生機制對其治療具有重要意義［9］。目前認為，脛骨癌痛動物模型的疼痛表現與臨床上所見的骨轉移癥狀相似，可視為骨轉移癌疼痛模型。Walker256大鼠乳腺癌細胞來源于大鼠原發性乳腺癌組織，具有較好的骨侵襲能力，應用該瘤細胞建立的乳腺癌骨轉移模型，具有重要的科研價值［10］。

本研究結果顯示，假手術組的機械痛閾和熱痛痛閾與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）;手術組大鼠術后手術側后足機械痛閾和熱痛痛閾值在造模6～7 d開始下降，與假手術組大鼠比較差異有統計學意義（P＜0.05），且造模后28 d，組織學結果顯示有腫瘤破壞骨質的證據。表明本研究成功建立Walker256大鼠乳腺癌骨轉移癌疼痛模型，且本研究細胞造模的成模時間以及痛覺行為與文獻報道基本一致，并表現出許多與人類骨轉移癌痛相似的特征［10］。

本研究發現地塞米松能夠有效緩解大鼠Walker 256乳腺癌骨轉移疼痛模型機械刺痛。地塞米松對骨轉移疼痛模型熱痛的影響本研究未測試。地塞米松是一種人工合成的糖皮質激素，是抗炎、抗過敏藥物，主要作為危重疾病的急救用藥和各類炎癥的治療。阿片類藥物是晚期癌癥鎮痛的基本用藥，但其存在耐受性、成癮性以及嚴重并發癥等嚴重缺點［11］。單獨增加阿片類藥物的劑量并不能達到理想的鎮痛效果。地塞米松適用于此類并發癥及對其敏感的惡性腫瘤。有研究發現，單獨使用地塞米松或聯合其他鎮痛藥物對中、重度癌痛患者可達到完全或明顯緩解的效果。其可能的止痛機制包括：通過減輕腫瘤周圍組織水腫，緩解疼痛敏感結構的受壓狀態;或促使對類固醇有反應的惡性腫瘤萎縮;或通過減少某些炎性介質，如前列腺素和白三烯的組織濃度以降低傷害性感受器的活性［12－13］。

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（本文編輯：劉斯靜）

Effect of dexamethasone on rat bonemetastasis pain induced by Walker 256 mammary gland carcinoma cells

ZHANG Fan，LIYi，DING Jie，ZHANG Hai－lin*
（ Department of Pharmcology，the Basic Medical College of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

Objective To establish a ratmodel of bone metastasis pain induced by Walker 256 mammary gland carcinoma cells and observe the effect of dexamethasone on bone cancer pain.MethodsAscitic tumour cells were made from Walker256mammary gland carcinoma cells injected to tibia of rats.Then，the withdrawal threshold to mechanical stimulus and withdrawal time in response to radiant thermal stimulus were tested before and after operation.ResultsThe withdrawal threshold to mechanical stimulus and withdrawal time in response to radiant thermal stimulus were significantly reduced in the tibia bone inoculated with Walker 256 cells.The pathology results showed the evidence of tibia bone structure was destructed by tumor.It is suggested that the model of bone metastasis pain induced by Walker 256 mammary gland carcinoma cell was successfully established.Dexamethasone（5 mg/kg） elevated withdrawal threshold to mechanical stimulus in rat model of bone metastasis pain induced by Walker256 mammary gland carcinoma cell.ConclusionDexamethasone could alleviate bone cancer pain.

neoplasms;dexamethasone;pain measurement

R965.1

A

1007－3205（2015）03－0249－04

2015－01－07;

2015－01－20

國家自然科學基金（31401199）;河北省自然科學基金（H2015206427）;河北省教育廳優秀青年基金（YQ2014030）;中國博士后科學基金第56批面上資助（2014M560194）

張凡（1986－），女，河北邢臺人，河北醫科大學基礎醫學院講師，理學博士，從事離子通道功能調節的研究。

*通訊作者。E－mail：z.hailin@yahoo.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.001