HPV E6/E7 mRNA在CIN II及以上病變中的診斷價值

黃凌霄，潘瓊慧，鄭建瓊，朱雪燕，朱雪瓊

（1.溫州醫科大學第三臨床學院 溫州市人民醫院 婦產科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 婦產科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

HPV E6/E7 mRNA在CIN II及以上病變中的診斷價值

黃凌霄1，潘瓊慧1，鄭建瓊1，朱雪燕1，朱雪瓊2

（1.溫州醫科大學第三臨床學院 溫州市人民醫院 婦產科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 婦產科，浙江 溫州 325027）

目的：探討人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA檢測在CIN II及以上宮頸病變（CIN II+）診斷中的應用價值。方法：2014年1月至9月在溫州市人民醫院婦科門診行宮頸篩查發現新柏超薄液基細胞學檢查（TCT）≥未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）和/或高危HPV DNA陽性的患者426例，其中TCT結果為ASCUS者156例，均行宮頸HPV E6/E7 mRNA檢測和組織病理學檢查。根據病理結果將病例分為5組，分析HPV E6/ E7 mRNA拷貝數與病變程度的相關性。利用受試者工作特征（ROC）曲線評價HPV E6/E7 mRNA對ASCUS患者CIN II+的預測價值。結果：宮頸癌組HPV E6/E7 mRNA拷貝數最高，慢性子宮頸炎組拷貝數最低。Spearman等級相關分析顯示組織學病變程度與HPV E6/E7 mRNA水平與之間存在正相關性（r=0.549，P＜0.001)。在CIN II+中，HPV E6/E7 mRNA陽性率為91.6%，HR-HPV DNA陽性率為93.0%，差異無統計學意義（x2=0.197，P＞0.05）。ROC曲線顯示，HPV E6/E7 mRNA預測CIN II+最佳臨界值為147.965。HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA檢測預測ASCUS患者CIN II+的靈敏度、陰性預測值相比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；兩者特異度、陽性預測值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：隨著宮頸病變程度增加，HPV E6/ E7 mRNA拷貝數相應增加。與HPV DNA檢測方法相比，HPV E6/E7 mRNA檢測對ASCUS患者CIN II+的特異度、陽性預測值更高，可作為ASCUS患者分流管理的有效措施。

E6/E7 mRNA；人乳頭瘤病毒；DNA；宮頸病變

高危型人乳頭瘤病毒（high risk-human papilloma virus，HR-HPV）持續感染是宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌發生的主要病因，特別是HPV癌基因E6/E7的表達對于惡性腫瘤的轉歸和維持起著重要作用，但由于E6/E7感染宿主的環境因素的差異，感染的自然進展在不同人群間存在著差異，在不同病變級別的宮頸組織中也存在著差異。本研究采用支鏈DNA信號放大技術（branched DNA，bDNA）檢測HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變中的表達水平，探討各級別間HPV E6/E7 mRNA拷貝情況，評估其在CIN II及以上宮頸病變早期診斷中的應用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2014年1月至9月因新柏超薄液基細胞學檢查（thin-prep cytology test，TCT）≥未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（atypical squa

mous cells of undermined significance，ASCUS）和/或HR-HPV DNA陽性的患者426例，均行HPV E6/ E7 mRNA檢查及陰道鏡下宮頸活檢，其中TCT結果為ASCUS 156例。426例患者年齡24～76歲，均無CIN史、盆腔放射治療史、子宮切除史，排除妊娠，取材前3 d內無性生活史。

1.2 方法

1.2.1 TCT檢查：宮頸刷插入宮頸外口旋轉5周，采集宮頸表面及宮頸管內脫落細胞，將細胞洗脫在新柏氏膜式液基液中，用TCT專用制片機制成薄層涂片，經巴氏染色后鏡檢。宮頸細胞學診斷按照國際癌癥協會推薦的TBS分類法，具體分為未見上皮內瘤變或惡性細胞（negative for intraepithelial lesion and malignancy，NILM）、ASCUS、不排除高度鱗狀上皮病變的非典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells cannot exclude HSIL，ASC-H）、低度鱗狀上皮內瘤變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鱗狀上皮內瘤變（high-squamous intraepithelial lesion，HSIL）及鱗癌（squamous cell cancer，SCC）。

1.2.2 HPV DNA檢測：用HPV專用毛刷取材，將鱗柱上皮交界處和宮頸管采集的細胞洗脫在HPV專用取樣瓶中。采用PCR反向點雜交技術進行分型。共分23種亞型，低危型5種，包括HPV 11、42、43、6、81；高危型18種，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83。1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測：采用bDNA法檢測脫落細胞中14種HR-HPV E6/E7 mRNA水平，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68。試劑盒購自河南中美合資科蒂亞生物技術有限公司，嚴格按照說明書進行操作。標本采用冷光儀檢測，檢測結果為光子數，經計算軟件轉換為拷貝數，拷貝數＞0 copy/mL為陽性。

1.2.4 組織病理學檢查：TCT≥ASCUS和/或HR-HPV DNA陽性的患者行陰道鏡下宮頸活檢。病理學診斷分為：慢性子宮頸炎、CINI、CIN II、CIN III、宮頸癌，診斷標準參照《婦產科學》[1]。對病理檢查結果≥CIN II的患者行宮頸環形電切術或宮頸錐切術，以獲取進一步病理診斷。若不同部位有不同級別診斷，以病理級別最高者作為最后診斷。

1.3 統計學處理方法 對5組不同宮頸病變的HPV E6/E7 mRNA拷貝數進行探索性研究，結果用箱線圖表示。采用SPSS19.0統計軟件進行分析，HPV E6/E7 mRNA拷貝數比較采用Mann-Whitney檢驗。率的比較采用x2檢驗或Fisher精確概率檢驗。相關性分析采用Spearman等級相關分析。診斷價值采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理檢查結果與HPV E6/E7 mRNA拷貝數比較由圖1可見，5組不同級別宮頸病變的HPV E6/E7 mRNA拷貝數均呈偏態分布，隨著病變級別增高，HPV E6/E7 mRNA拷貝數有增高趨勢。對各組HPV E6/E7 mRNA拷貝數進行分析（見表1），宮頸癌組HPV E6/ E7 mRNA拷貝數最高，慢性子宮頸炎組最低，CIN II與CIN III組拷貝數差異無統計學意義（P＞0.05）。將宮頸組織病理結果與HPV E6/E7 mRNA水平進行Spearman等級相關分析，兩者相關系數r=0.549（P＜0.001），提示HPV E6/E7 mRNA水平與組織學病變程度之間存在正相關性。

圖1 組織學不同級別病變HPV E6/E7 mRNA水平的箱線圖

表1 組織學不同級別病變HPV E6/E7 mRNA拷貝數比較（copy/ mL）

2.2 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA及病理檢查結果由表2可見，各組間HPV E6/E7 mRNA陽性率有差異。CIN II+組（CIN II、CIN III、宮頸癌）HPV E6/E7 mRNA陽性率顯著高于慢性子宮頸炎和CINI組，差異有統計學意義（P＜0.001）。HPV E6/E7 mRNA和HRHPV DNA檢測相比較，兩者對于CIN II+的檢出率差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA表達與宮頸病變之間關系n（%）

2.3 HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA對ASCUS患者CIN II+的診斷 接受宮頸活檢的426例患者中TCT結果為ASCUS者156例。由圖2可見，HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA診斷ASCUS患者CIN II及以上宮頸病變的ROC曲線下面積分別為0.800（95%CI：0.727～0.873）、0.563（95%CI：0.470～0.657）。HPV E6/E7 mRNA檢測的臨界值為147.965，以HPV E6/E7 mRNA拷貝數≥147.965為預測界值，其預測CIN II+的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為90.0%、64.2%、54.2%、93.2%。HR-HPV DNA陽性預測CIN II+的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為94.0%、22.6%、36.4%、88.9%。兩方法預測CIN II+的靈敏度、陰性預測值差異無統計學意義（P＞0.05），但HPV E6/E7 mRNA預測CIN II+的特異度、陽性預測值均高于HR-HPV DNA檢測（P＜0.05），見表3。

圖2 HPV E6/E7 mRNA與HR-HPV DNA預測ASCUS患者CIN II+的ROC曲線

表3 ASCUS患者HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA表達與宮頸病變之間關系（例）

3 討論

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，HPV感染是宮頸癌發生的主要危險因素。幾乎100%的高級別CIN以及宮頸癌都合并HPV感染[2]。其發生的分子機制是病毒DNA將以E6/E7為主的基因片段整合到宿主細胞的DNA中，通過激活調節病毒生長的E6/E7基因片段，致E6/E7癌基因蛋白的持續性高表達，使宿主細胞性質發生改變，進而向宮頸高度病變進展[3]。因此HPV E6/E7表達上調是宮頸細胞向惡性轉變所必需的。

HPV DNA檢測現廣泛用于宮頸病變的篩查和隨訪，尤其是在ASCUS患者的分流中有重要作用。ASCUS的診斷標準為細胞出現比單純反應性改變更加顯著的異常特征，但未達到診斷鱗狀上皮內病變的程度，其可能提示慢性子宮頸炎、CIN，甚至是宮頸癌[4-5]。故應十分重視和加強對ASCUS患者及時、有效地評價和管理，防止宮頸浸潤癌的發生。2012年美國陰道鏡和病理學會（American Society of Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）提出對于ASCUS的最佳方案為反饋性HPV檢測，陽性者行陰道鏡檢查[6]。但HPV DNA檢測不能區分宮頸退行性HPV感染、持續性HPV感染及進行性發展的HPV感染，且HPV DNA在凋亡細胞及細胞碎屑中也可表達，這導致HPV DNA陽性結果不能準確說明致癌風險，反而增加患者對宮頸癌的精神心理負擔，甚至出現過度治療[7-8]。因此需采取更好的方法對ASCUS患者的HPV感染進行檢測，進一步篩選出高級別宮頸病變甚至是宮頸癌。

本研究發現，CIN II+（CIN II、CIN III、宮頸癌）組HPV E6/E7 mRNA陽性率高于CINI-（慢性子宮頸炎、CINI）組，且不同等級宮頸病變的HPV E6/E7 mRNA拷貝數不同，慢性子宮頸炎組拷貝數最低，宮頸癌組拷貝數最高，HPV E6/E7 mRNA水平與組織學病變程度之間存在正相關性。因此在宮頸篩查過程中，HPV E6/E7 mRNA水平越高，更需警惕宮頸病變甚至是宮頸癌的可能。而HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA檢測相比，對CIN II+的檢出率差異無統計學意義，在兩種檢測結果均陽性的情況下，HPV E6/E7 mRNA拷貝水平就在宮頸病變嚴重程度的評估和處理方法的指導上具有更重要的意義。

本研究比較HPV E6/E7 mRNA及HR-HPV DNA檢測對ASCUS患者CIN II+的預測價值，通過ROC曲線分析，HPV E6/E7 mRNA的最佳臨界點為147.965，以最佳臨界點為篩選標準時，HPV E6/E7 mRNA預測ASCUS患者CIN II+的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為90.0%、64.2%、54.2%、93.2%。與HR-HPV DNA檢測相比，其特異度和陽性預測值均較高，靈敏度、陰性預測值相近。與本研究結果不同，Benevolo等[9]報道，對于ASCUS患者HPV E6/ E7 mRNA檢測預測CIN II+的靈敏度低于HR-HPV DNA檢測。目前用于檢測HPV E6/E7 mRNA水平的方法有核酸序列擴增法（如PCR、NASBA、TMA）和支鏈DNA信號放大技術，部分市售的試劑僅檢測HR-HPV l6、18、31、33、45中E6/E7 mRNA的轉錄[10]，而本研究所用試劑可檢測14種HR-HPV mRNA，故敏感性更高，與HR-HPV DNA檢測相比，在有更高特異性的前提下，不降低敏感度。

本研究中有2例HR-HPV DNA陰性，但HPV E6/E7 mRNA陽性者行宮頸活檢，病理報告為CIN III。Cattani等[11]使用多聚合PCR對HR-HPV DNA陰性、HPV E6/ E7 mRNA陽性的病例進行復查，可以檢測到病毒基因組E6區域的DNA，證明這些病例中仍存在非常低的病毒拷貝。可能是由于特殊的HPV DNA片段整合到宿主基因，整合后的L1基因缺失影響病毒復制，導致低病毒載量，但整合后的惡性表型卻能使E6/ E7癌基因持續過表達。因此，RNA比DNA分析能檢測出更多臨床上的顯著感染。2012版ASCCP的宮頸篩查指南提出，ASCUS患者合并HPV陰性時，可暫緩陰道鏡檢查，根據該處理原則可能會造成部分高級別宮頸病變的漏診。另外，指南將21～24歲婦女列為特殊人群，認為在該年齡段ASCUS患者的處理中，HPV DNA檢測并非最佳方案，即使結果陽性，仍不建議直接行陰道鏡檢查。本研究中有1例24歲的HPV 16型陽性ASCUS患者，HPV E6/E7 mRNA拷貝數達31 254.57，經患者知情同意后行陰道鏡下宮頸活檢，病理診斷為CIN II。雖然30歲以下尤其是25歲以下的年輕女性，子宮頸癌的發生率非常低，但隨訪過程中仍然有可能遺漏高級別宮頸病變。故TCT提示ASCUS的患者，可同時行HPV E6/E7 mRNA檢測，以及時篩選出高級別宮頸病變，預防宮頸浸潤癌的發生。

目前，國內宮頸篩查主要采用TCT聯合HPV DNA檢測。但HPV DNA檢測對于＜30歲婦女的檢測意義不大，因該年齡段婦女常合并HPV感染能自動清除。本研究慢性子宮頸炎患者中有部分病例HR-HPV DNA陽性但未檢測到HPV E6/E7 mRNA，這與HPV一過性感染的自然進程相符合。另有6例HR-HPV DNA陽性的CINI、CIN II患者HPV E6/E7 mRNA為陰性，有文獻報道大部分CINI可自行逆轉，甚至32%的CINI也可自行消退[12]，所以HPV E6/E7 mRNA陰性可能預示著疾病的逆轉，但這部分病例仍需嚴密隨訪。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA檢測不僅對ASCUS患者高級別病變具有較高的辨別能力，能更好地篩選出高危人群，為臨床醫生提供比DNA檢測更具有預測價值的檢測結果，而且排除可疑或低度病變的能力更強。在宮頸篩查中，尤其是對ASCUS患者行HPV E6/E7 mRNA檢測，能有效減少漏診，也避免了過度檢查、治療給患者帶來的痛苦和精神負擔。而HPV E6/E7 mRNA在30歲以下婦女中的應用價值，仍需要大樣本研究來證實。

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（本文編輯：丁敏嬌）

The diagnostic value of human papilloma virus E6/E7 mRNA detection in CINII+

HUANG Lingxiao1, PAN Qionghui1, ZHENG Jianqiong1, ZHU Xueyan1, ZHU Xueqiong2. 1.Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Clinical College of Wenzhou Medical University, Wenzhou People’s Hospital, Wenzhou, 325000; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To evaluate the application value of detecting human papilloma virus (HPV) E6/E7 mRNA as a diagnose test for CINII+. Methods: From January to October in 2014, a total of 426 gynecological outpatients, whose TCT≥ASCUS or/and high-risk HPV DNA positive, were found by cervical lesions screening in Wenzhou People’s Hospital. All those outpatients performed HPV E6/E7 mRNA detection and histopathological examination. According to different histological results, samples were divided into 5 groups, the correlation between the expression of HPV E6/E7 mRNA and the severity of cervical lesions were analyzed. The ROC curve was used to assess the predictive value of HPV E6/E7 mRNA for CINII+ of ASCUS. Results: The cervical cancer group had the highest level of HPV E6/E7 mRNA while the chronic cervical inflammation group had the lowest. Spearman rank analysis demonstrated that the severity of cervical lesions was proportional to the expression of HPV E6/E7 mRNA (r=0.549, P＜0.001). For CINII+, there was no significant difference between HPV E6/ E7 mRNA and high-risk HPV DNA in positive rate (x2=0.197, P＞0.05). The ROC curve showed that HPV E6/ E7 mRNA＞147.965 were superior to any other standards to scan CINII+. The sensitivity and negative predictive value of HPV E6/E7 mRNA and HR-HPV DNA in predicting CINII+ of patients with ASCUS showed no statistically significant difference (P＞0.05), while the specificity and positive predictive value showed statistically significant difference (P＜0.05). Conclusion: The copy number of HPV E6/E7 mRNA transcripts is correlated with severe degree of epithelial cervical dysplasia. The specificity and positive predictive value of HPV E6/E7 mRNAdetection are higher than those of HPV DNA for diagnosis of CINII+ in patients with ASCUS, therefore HPV E6/ E7 mRNA detection may be a valuable tool for triage and patient follow-up.

E6/E7 mRNA; human papilloma virus; DNA; cervical lesions

R711.74

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.009

2015-02-01

黃凌霄（1984-），女，浙江溫州人，住院醫師，在職碩士生。

朱雪瓊，教授，主任醫師，博士生導師，Email：zjwzzxq@163.com。