苦楝樹皮提取物對斜紋夜蛾的毒殺和拒食作用

葛軍軍，陳翩，黃依露，馮波，葉曉霞

（溫州醫科大學，浙江 溫州 325035，1.藥學院；2.環境與健康生態研究所）

·論 著·

苦楝樹皮提取物對斜紋夜蛾的毒殺和拒食作用

葛軍軍1，陳翩1，黃依露1，馮波2，葉曉霞1

（溫州醫科大學，浙江 溫州 325035，1.藥學院；2.環境與健康生態研究所）

目的：觀察苦楝樹皮提取物中不同極性組段對斜紋夜蛾幼蟲的毒殺與拒食作用，尋找活性成分主要存在的組段。方法：苦楝樹皮經95%乙醇冷浸提取，濃縮成浸膏，用乙酸乙酯萃取后得到粗提物，運用硅膠柱層析分離為不同極性的15個組段（K1～K15），采用葉碟法測定不同極性組段在低劑量（10-6g/mL）、中劑量（10-4g/mL）、高劑量（10-2g/mL）下對斜紋夜蛾幼蟲的取食葉面積與死亡率的影響。結果：苦楝樹皮提取物對斜紋夜蛾幼蟲具有明顯的拒食作用，且與劑量成正比。而K5、K6、K10組段在10-2g/mL濃度下表現出了強烈的毒殺作用，死亡率為100%。K11組段對斜紋夜蛾幼蟲也有一定的毒殺作用，死亡率為33.3%。K5、K6組段在10-6g/mL濃度下，均有較好的拒食作用。結論：K5、K6組段比K10、K11組段對斜紋夜蛾幼蟲具有更顯著的拒食與毒殺作用，且在K5、K6組段中有望分離得到單一活性成分。

苦楝樹皮；乙酸乙酯提取物；斜紋夜蛾；拒食活性；毒殺作用

植物源農藥以高效、低毒、低殘留、無公害等特點而獲得了越來越多的關注，尤其是在化學性農藥廣泛流行的現在，從植物中提取分離對昆蟲有防治作用的活性物質顯得尤為重要。

苦楝（Melia azedarach Linn.）隸屬楝科，為楝科落葉喬木植物，是藥用植物[1-6]。《中國藥典》中記載，苦楝具有殺蟲等藥用價值。現代藥理學研究表明，其次級代謝產物，尤其是三萜類化合物常表現出昆蟲拒食活性[7-8]。但此類研究往往集中于乙醇粗提取物，對苦楝中單一活性化合物的毒殺與拒食活性研究鮮見報道。因此，本研究采用葉碟法，觀察苦楝樹皮乙酸乙酯提取物及其不同極性組段對斜紋夜蛾幼蟲（Spodoptera litura）[9]的拒食作用，以希望找到活性單體主要存在的組段，對其進行分離純化，為開發天然、綠色的農藥奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲：斜紋夜蛾幼蟲，齡期為4～6齡，采集自浙江省溫州市甌海區芋田內，置于28 ℃室內用卷心菜菜葉飼養，繁殖2代后，挑選健康、大小一致的幼蟲供試。

1.1.2 試劑與儀器：硅膠H及薄層層析硅膠板HSGF254（青島海洋化工有限公司）；茴香醛顯色劑（實驗室自配：135 mL無水乙醇+5 mL濃硫酸+1.5 mL冰醋酸+3.7 mL茴香醛）；乙醇、石油醚、乙酸乙酯（無錫市佳妮化工有限公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海科學儀器有限公司）；R-205型旋轉式蒸發儀（瑞士BUCHI公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦楝樹皮乙酸乙酯提取物的提取：取干燥的苦楝樹皮樣品10.6 kg，粉碎，用95%乙醇冷浸3次，每次冷浸7 d。合并冷浸后的提取液，減壓回收乙醇至無醇味，濃縮得到濃浸膏約200 g。將上述得到的濃浸膏用蒸餾水混懸，再用乙酸乙酯萃取數次，減壓濃縮，得到乙酸乙酯提取物160 g，從中取200 mg，溶于50%乙醇中配置成不同濃度的溶液，冷藏備用。

1.2.2 苦楝樹皮乙酸乙酯提取物的分離：取苦楝樹皮乙酸乙酯提取物145 g，用硅膠柱色譜進行分離，采用石油醚/乙酸乙酯（20∶1→1∶1）梯度洗脫，薄層層析硅膠板跟蹤，合并相似成分，共得到15個不同極性組段（K1～K15）。分別取各組段200 mg，溶于50%乙醇中配置成不同濃度（10-2g/ mL、10-4g/mL、10-6g/mL）的溶液，冷藏備用。鑒于三萜類活性物質為中、小極性化合物，故本研究著重對中、小極性組段（K4～K13）進行活性實驗。1.2.3 拒食活性的測定：采用葉碟法[10]，將卷心菜菜葉清洗干凈，晾干。用方形打孔器（2.5 mm× 2.5 mm）打成葉碟，放入供試樣品的稀釋液（50%乙醇稀釋）中浸泡5 s，對照組則放入50%乙醇水溶液中浸泡5 s。取出葉碟在陰涼處揮發，待溶劑揮發完全后放入墊有濾紙（加少量蒸餾水保濕）的培養皿（直徑9 cm）中。每個培養皿放入1片葉碟，接入已饑餓2 h的試蟲1頭，每隔2 h后用方格紙分別計算試蟲取食葉面積（mm2）。每天重復上述操作3次，其余時間喂食未經處理的菜葉。試蟲化蛹時則實驗結束。拒食率的計算公式：

1.2.4 毒殺作用的測定：采用浸葉接蟲法[11]，將卷心菜菜葉清洗干凈，晾干。用方形打孔器（2.5 mm× 2.5 mm）打成葉碟，放入供試樣品的稀釋液（50%乙醇稀釋）中浸泡5 s，對照組則放入50%乙醇水溶液浸泡5 s。取出葉碟在陰涼處揮發，待溶劑揮發完全后放入墊有濾紙（加少量蒸餾水保濕）的培養皿（直徑9 cm）中。每個培養皿放入5片葉碟，接入試蟲1頭（防止饑餓時互相撕咬，影響實驗結果），每隔24 h觀察試蟲死亡數，并更換新鮮處理葉碟。連續記錄72 h。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。所有數據均為計量資料，以表示。組間差異比較采用One-way ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 苦楝樹皮乙酸乙酯提取物對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用 如表1所示，不同濃度的苦楝樹皮乙酸乙酯提取物對斜紋夜蛾幼蟲有明顯的拒食活性，拒食活性的高低與濃度成正比。

表1 苦楝樹皮乙酸乙酯提取物對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用（n= 18，）

表1 苦楝樹皮乙酸乙酯提取物對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用（n= 18，）

注：數據右上角不同的字母表示各組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）

組別平均每次取食面積（mm2）平均每次拒食率（%）苦楝樹皮10-2g/mL12.15±1.49a66苦楝樹皮10-4g/mL18.59±2.32b47苦楝樹皮10-6g/mL24.78±3.34c30對照組35.22±4.44d0

2.2 苦楝樹皮各組段在不同濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的毒殺效果 在10-2g/mL濃度下，含有K5、K6、K10組段的葉碟喂食試蟲1 h后，試蟲開始出現死亡現象，并且死亡率均達到了100%，對試蟲表現出了強烈的毒殺作用。含有K11組段的葉碟喂食試蟲2 d后，試蟲開始出現死亡現象，死亡率為33.3%，而喂食了其他組段的試蟲死亡率均為0，無毒殺作用。在10-4g/mL、10-6g/mL濃度下，所有試蟲死亡率均為0，無毒殺作用。

2.3 苦楝樹皮各組段在不同濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食測定

2.3.1 各組段在10-2g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用：在上述的毒殺實驗中，K5、K6、K10組段表現出強烈的毒殺作用，因此，這3組不列入10-2g/mL濃度下拒食活性測定。對無（弱）毒殺作用的組段（K4、K7～K9、K11～K13）進行了拒食活性測定。結果如表2所示，在10-2g/mL濃度下，各組段處理過的葉碟喂食試蟲后，試蟲均表現出了拒食活性。但K4組段對試蟲平均每次的拒食率下降幅度很大，由于本研究著重探尋活性成分主要存在的組段，故K4組段不列入后續研究。

表2 各組段在10-2g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用（n=18，）

表2 各組段在10-2g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用（n=18，）

注：數據右上角不同的字母表示各組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05），相同的字母表示各組間兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）

組段蟲齡平均每次取食面積（mm2）平均每次拒食率（%）K44 8.16±1.07e81.8 K74 2.56±0.26c94.3 K84 4.47±0.73d90.0 K94 4.38±0.68d90.0 K114 0.34±0.09a99.2 K124 1.27±0.21b97.2 K134 5.01±0.41d88.8對照444.88±4.14f0 k4556.39±3.45e40.9 k75 7.58±1.13c92.1 k85 8.55±1.36c91.0 k95 8.81±1.03c90.8 k115 0.68±0.18a99.3 k125 2.57±0.41b97.3 k135 37.6±1.58d60.6對照595.49±7.01f0 k46211.93±7.57f033.7 k7619.40±2.47b93.9 k8629.16±2.16c90.9 k9629.29±1.64c90.8 k116 0.82±0.43a99.7 k12645.94±3.22d85.6 k13658.92±3.32e81.6對照6319.61±12.08g0

2.3.2 各組段在10-4g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用：如表3所示，在10-4g/mL濃度下，對4齡試蟲而言，各組段均有拒食作用。對5齡試蟲而言，K8、K9、K11、K12組段無拒食作用，此外K13組段的拒食作用也較弱，其余各組段的拒食作用均較明顯。對6齡試蟲而言，K9、K12組段無拒食作用，而K8、K11、K13組段的拒食作用也很弱，拒食率均在15%以下，其余各組段的拒食作用均較明顯。而K8、K9、K11、K12、K13組段對試蟲平均每次的拒食率下降幅度最明顯，由于本實驗著重探尋活性成分主要存在組段，故接下來K8～K9、K11～K13組段不列入研究對象。

表3 各組段在10-4g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用（n=18，）

表3 各組段在10-4g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用（n=18，）

注：數據右上角不同的字母表示各組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05），相同的字母表示各組間兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）

組段蟲齡平均每次取食面積（mm2）平均每次拒食率（%）K5409.71±1.33ab70.5 K646.53±1.06a80.2 K7412.14±1.34c0 63.2 K8431.22±1.89e0 5.4 K9421.50±1.84d0 34.8 K1046.24±1.26a81.1 K114 8.24±0.95ab75.0 K12420.19±1.55d038.8 K13411.05±1.10bc66.5對照432.98±5.64e00 K55 21.9±3.93ab68.3 K6513.59±1.42a080.3 K7520.41±1.82b070.4 K8587.80±8.92de-27.2 K95109.23±9.02e0-58.2 K10524.07±2.63b065.1 K11576.61±9.10d0-10.1 K125 97.30±12.96de-40.9 K13549.02±4.30c029.0對照569.04±6.70d00 K5666.17±2.77b079.9 K6647.24±4.88a085.7 K7683.85±4.08c074.6 K86323.93±14.94de1.8 K96371.46±13.84g0-12.6 K10688.76±3.51c073.1 K116286.77±10.30d013.1 K126359.73±11.79fg-9.0 K136314.56±14.66de4.7對照6329.93±14.30ef0

2.3.3 各組段在10-6g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用：如表4所示，在10-6g/mL濃度下，所有組段對各齡期試蟲均有拒食作用，尤其是K5、K6組段，平均每次的拒食率下降幅度很少，拒食效果最好。實驗表明K5、K6組段為拒食活性成分主要存在的組段，對此兩組段進行分離純化，有望得到單一活性化合物。

表4 各組段在10-6g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用（n=18，）

表4 各組段在10-6g/mL濃度下對斜紋夜蛾幼蟲的拒食作用（n=18，）

注：數據右上角不同的字母表示各組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05），相同的字母表示各組間兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）

組段蟲齡平均每次取食面積（mm2）平均每次拒食率（%）k54 13.59±3.34ab60.3 k64 12.25±1.00a64.2 k74 11.39±1.39a66.8 k104 17.99±2.03b47.6對照4 34.30±2.30c0 k55 51.14±1.21a66.2 k65 64.88±0.62b57.1 k75 96.80±1.95c36.0 k105 97.33±1.53c35.7對照5151.27±9.21d0 k56198.66±2.12a42.9 k66207.77±1.39a40.3 k76318.83±2.63b8.4 k106317.35±3.35b8.8對照6347.93±7.10c0

3 討論

斜紋夜蛾主要以幼蟲危害植物全株，是一種危害性很大的害蟲。本研究特選擇此蟲進行拒食活性研究，結果顯示，苦楝樹皮乙酸乙酯提取物在10-2g/ mL、10-4g/mL、10-6g/mL下對斜紋夜蛾幼蟲有明顯的拒食活性，且與濃度成正比，證明苦楝樹皮中存在拒食活性成分。將苦楝樹皮乙酸乙酯提取物進行進一步分離得到不同極性組段（K1～K15）。斜紋夜蛾幼蟲的毒殺結果顯示，K5、K6、K10組段在10-2g/mL濃度下表現出強烈的毒殺作用，K11組段對斜紋夜蛾幼蟲也有一定的毒殺作用，而其在10-4g/mL和10-6g/mL濃度下無毒殺作用。這提示我們在這4個組段中存在單一活性物質，在高濃度下對斜紋夜蛾幼蟲有毒殺作用。此外，斜紋夜蛾幼蟲的拒食結果顯示，K5、K6組段即使在10-6g/mL濃度時，仍有較好的拒食作用，這表示對斜紋夜蛾幼蟲有拒食作用的成分主要分布在這兩個組段。

在后續研究中，我們對K5、K6組段進行了分離純化，并得到了14個單一化合物（數據另文發表）。各單一化合物對斜紋夜蛾幼蟲的拒食活性尚在研究中。

[1] 李桂英, 支國. 苦楝皮提取物的抗腫瘤活性研究[J]. 安徽農業科學, 2012, 40(11): 6433-6434.

[2] 葉銀英, 何道偉. 苦楝、黃藥子抗癌成分的細胞學評價[J].中國生化藥物雜志, 1998, 19(4): 187-188.

[3] Guo C, Wang JS, Zhang Y, et al. Relationship of chemical structure to in vitro anti-inflammatory activity of tirucallane triterpenoids from the stem barks of Aphanamixis grandifolia[J]. Chem Pharm Bull, 2012, 60(8): 1003-1010.

[4] 翟興禮, 王啟明, 王立娟. 苦楝果實提取物對幾種芽孢菌的抑菌活性[J]. 安徽農業科學, 2006, 34(9): 1908-1909.

[5] 姜萍, 葉漢齡, 安鑫南. 苦楝提取物的提取及其抑菌活性的研究[J]. 林產化學與工業, 2004, 24(4): 23-27.

[6] 沈雅琴, 張明發, 朱自平, 等. 苦楝皮的鎮痛抗炎和抗血栓形成作用[J]. 中國藥業, 1998, 13(10): 30-31.

[7] 王文陸, 趙善歡, 韓玖, 等. 苦楝中幾種殺蟲有效成分對菜青蟲和亞洲玉米螟的生物活性[J]. 植物保護學報, 1992, 19(4): 359-364.

[8] 顧靜文, 劉立鼎, 肖憶良, 等. 苦楝果實植物殺蟲劑的開發研究[J]. 江西科學, 1995, 13(3): 142-148.

[9] Mathews RW, Mathews JR. Insect behavior[M]. Springer Netherlands, 1978: 245-254.

[10] 林啟壽. 中草藥成分化學[M]. 北京: 科學出版社, 1977: 538-539.

[11] 張宗炳. 殺蟲藥劑的毒力測定[M]. 北京: 科學出版社, 1988: 433-434.

（本文編輯：吳昔昔）

Antifeeding and toxic activity of ethyl acetate extract from barks of Melia azedarach L against Spodoptera

litura larvaeGE Junjun1, CHEN Pian1, HUANG Yilu1, FENG Bo2, YE Xiaoxia1. 1.School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Institute of Healthy & Environmental Ecology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: In order to find new compounds with strong antifeeding activities, the crude extract and fractions from barks of Melia azedarach L. were selected for their antifeeding and toxic activity against Spodoptera litura larvae. Methods: The 95% ethanol extract of the barks of Melia azedarach L. was concentrated, and the aqueous solution was partitioned with ethyl acetate. The ethyl acetate extract was subjected to silica gel CC eluted with ether-ethyl acetate to give 15 fractions (K1～K15). The fractions were investigated against Spodoptera litura larvae by leaf disc method to test the leaf area and the mortality. Results: Ethyl acetate extract from barks of Melia showed significant antifeeding activity against Spodoptera litura larvae, which was improved with increased dosages. Fractions 5, 6, 10 displayed strong toxic effects, and Fraction 11 also indicated toxic effects. Fractions 5, 6 revealed strong antifeeding activity even at the low concentration. Conclusion: Fractions 5, 6 demonstrate obvious antifeeding and toxic activity against Spodoptera litura larvae than Fractions 10, 11. The fractions which reflect stronger antifeeding activity will be isolated and purifies in hoping of achieving the new active compounds.

Melia azedarach barks; ethyl acetate extract; Spodoptera litura larvae; antifeedant; toxic

R979.8

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.002

2015-05-08

浙江省自然科學基金資助項目（LY12B02007）。

葛軍軍（1989-），女，浙江湖州人，碩士生。

葉曉霞，教授，碩士生導師，Email：yxx@wmu.edu. cn。