柚皮素對RSV A2株感染引起氣道黏液高分泌的抑制作用

孟珊珊，呂芳芳，胡曉光，張海鄰，李昌崇

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童呼吸科，浙江 溫州 325027；2.鄒城市人民醫(yī)院兒科，山東 濟寧 273500）

·論 著·

柚皮素對RSV A2株感染引起氣道黏液高分泌的抑制作用

孟珊珊1，2，呂芳芳1，胡曉光1，張海鄰1，李昌崇1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童呼吸科，浙江 溫州 325027；2.鄒城市人民醫(yī)院兒科，山東 濟寧 273500）

目的：探討柚皮素（Nar）對呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起的氣道黏液高分泌的作用。方法：通過RSV A2株感染人肺腺癌上皮細(xì)胞構(gòu)建氣道黏液高分泌細(xì)胞模型，在RSV感染及Nar干預(yù)作用下，采用實時熒光定量PCR、ELISA和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測各組細(xì)胞黏蛋白（MUC）5AC的表達(dá)情況。結(jié)果：RSV感染R1組[感染復(fù)數(shù)（MOI）=0.5]、R2組（MOI=1.0）、R3組（MOI=5.0）和對照組（C組）MUC5AC mRNA相對表達(dá)量分別為1.45±0.10、2.67±0.09、4.82±0.27和1，各組MUC5AC蛋白的表達(dá)量分別為（38.61±0.41）μg/L、（44.11± 0.96）μg/L、（51.01±0.48）μg/L和（34.38±0.95）μg/L，RSV感染組和C組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。R2組和不同濃度Nar干預(yù)組N1組（Nar 30 μmol/L+RSV MOI=1.0）、N2組（Nar 100 μmol/L+RSV MOI=1.0）、N3組（Nar 30 μmol/L）、N4組（Nar 100 μmol/L）及DMSO組（D組）的MUC5AC mRNA水平依次為2.52±0.10、2.31±0.06、1.90±0.01、0.99±0.04、0.85±0.03、1.20±0.03，MUC5AC蛋白水平依次為（46.72±0.87）μg/L、（43.60±0.45）μg/L、（40.55±0.45）μg/L、（38.73±0.55）μg/L、（37.08±1.35）μg/L、（37.12±0.91）μg/L，C組MUC5AC蛋白水平為（37.62±1.18）μg/L，與C組相比，R2組MUC5AC mRNA和蛋白水平顯著增加（P＜0.05），N1、N2組與R2組相比，MUC5AC mRNA和蛋白水平顯著降低，隨Nar濃度增加，抑制效果更明顯，呈劑量相關(guān)性（P＜0.05），N3、N4組與C組相比，MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），D組與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示RSV感染后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)MUC5AC蛋白表達(dá)增加，而Nar可下調(diào)其表達(dá)。結(jié)論：RSV A2株感染A549細(xì)胞會導(dǎo)致MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)增加，Nar通過抑制其表達(dá)，抑制RSV感染引起的氣道黏液高分泌。

柚皮素；呼吸道合胞病毒；氣道黏液高分泌；黏蛋白5AC

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒病原，每年因RSV感染導(dǎo)致全球大約2%的確診病例死亡[1]。RSV下呼吸道感染的主要病理改變是細(xì)支氣管上皮的壞死脫落、黏液分泌增加、炎性細(xì)胞浸潤、黏膜充血水腫、氣道反應(yīng)性增高等[2]，其中黏液高分泌引起的氣道阻塞起著十分重要的作用[3-4]。研究RSV感染引起氣道黏液高分泌的機制并加以干預(yù)，對減輕RSV下呼吸道感染疾病嚴(yán)重度有十分重要的臨床意義。

黏蛋白（mucin，MUC）是氣道黏液中最具生理學(xué)意義的成分，其中MUC5AC和MUC5B構(gòu)成了氣道分泌蛋白的95%～98%[5]。多種刺激因素可導(dǎo)致MUC表達(dá)上調(diào)，例如臭氧、煙霧、細(xì)胞因子、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、細(xì)菌產(chǎn)物、病毒等[5]。柚皮素（Naringenin，Nar）是一類天然黃酮類化合物，廣泛存在于柚子、化橘紅、桃葉等中。研究證實，Nar除具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)的作用[6]外，還具有止咳化痰的功效，可減輕氣道的黏液高分泌[7-8]。Nar是否對RSV感染引起的氣道黏液高分泌有效鮮見報道。為此，筆者通過觀察RSV A2株感染人肺腺癌上皮細(xì)胞（A549）氣道黏液高分泌模型中MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及Nar干預(yù)后表達(dá)水平的變化，探討Nar對RSV感染引起氣道黏液高分泌的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株與病毒株：人肺腺癌上皮細(xì)胞A549株和人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2株購自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，RSV A2株購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.2 藥物：Nar（Sigma，美國）溶于二甲基亞砜（DMSO）溶液中，配成0.1 mmol/L母液，避光-20 ℃保存，實驗時用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。DMSO終濃度＜0.1%。

1.1.3 主要試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國），1640培養(yǎng)液（Gibco，美國），胎牛血清（四季青，中國），Trizol（Invitrogen，美國），反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-RCR）試劑盒（Thermo，美國），SYBR Green I Master（Roche，美國），LightCycler480實時熒光定量PCR儀（Roche，美國），引物設(shè)計合成（上海基康生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：A549和Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的1640和DMEM培養(yǎng)基（加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）中，置于5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合至80%～90%傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后接種于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁，融合至70%時換成細(xì)胞維持液（含2%的胎牛血清）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8法測定Nar對A549細(xì)胞的增殖毒性：將對數(shù)期A549細(xì)胞消化后以1×104/mL接種于96孔板中，每孔接種100 μL，待其生長至80%左右時，用PBS清洗2遍后，加入含30、50、80、100、200、400、800 μmol/L Nar的培養(yǎng)液100 μL，每個濃度設(shè)置8個復(fù)孔，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各孔中加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育1 h后酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度A值。

1.2.3 RSV培養(yǎng)及滴度測定：RSV接種于對數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞中，在DMEM維持液中培養(yǎng)，待病變＞75%時收獲病毒（約3～5 d），置-20 ℃≥2 h，37 ℃反復(fù)凍融4次，10 000 r/min離心10 min，取上清存-80 ℃冰箱中備用。病毒滴度通過在96孔板細(xì)胞中測病毒的半數(shù)感染量TCID 50/mL表示。根據(jù)實驗加入不同的感染量，以感染復(fù)數(shù)（multiplication of infection，MOI）表示，MOI為病毒數(shù)和細(xì)胞數(shù)比例。

1.2.4 實驗分組：RSV感染組包括R1組（MOI=0.5）、R2組（MOI=1.0）、R3組（MOI=5.0），各組加入不同感染量的RSV吸附2 h后，換為新的維持液培養(yǎng)；Nar干預(yù)組包括N1組（Nar 30 μmol/L+RSV）、N2組（Nar 100 μmol/L+RSV），在感染前加入Nar預(yù)處理1 h，RSV感染后加入含Nar培養(yǎng)液培養(yǎng)，RSV MOI=1.0；Nar組包括N3組（Nar 30 μmol/L）、N4組（Nar 100 μmol/L），加入含不同濃度的Nar培養(yǎng)液培養(yǎng)；DMSO組（D組）加入含0.1%的DMSO培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；對照組（C組）為細(xì)胞維持液培養(yǎng)。各組均培養(yǎng)24 h后檢測相應(yīng)指標(biāo)，每組均重復(fù)3次。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳：收集RSV感染組和C組細(xì)胞，裂解提取mRNA，用RSV G蛋白基因的引物做RTPCR，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RSV是否成功感染A549細(xì)胞。G蛋白引物：上游為5’-TGGGACACTCTTAAT CAT-3’，下游為5’

-TGATTCCAAGCTGAGGAT-3’。

1.2.6 實時熒光定量PCR法檢測MUC5AC mRNA的表達(dá)：以Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，并測定RNA濃度及純度（A260/A280＞1.8）。根據(jù)濃度取2 μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性90 s，95 ℃退火5 s，58 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)，獲得各樣本待測基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其結(jié)果代表目的基因的相對含量，以C組作為矯正樣本。MUC5AC上游引物：5’-GACACCAAATACGCCAACAA-3’，下游引物：5’-GGGTCGTCCATCTTCTGC-3’；GAPDH上游引物：5’-CACCATCTTCCAGGAGCGA-3’，下游引物：5’-GG CAGAGATGATGACCCTTTTG-3’。

1.2.7 ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液MUC5AC蛋白水平：取培養(yǎng)上清液，1 500 r/min離心5 min后-80 ℃凍存，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀450 nm測定各孔MUC5AC蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量資料以表示，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV感染氣道上皮細(xì)胞 通過Reed-Muench公式計算RSV滴度為107.0TCID 50/mL，即7×106PFU/ mL。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RSV感染組（R1、R2、R3組）采用RSV A株G蛋白引物在250 bp處擴增出一條清晰的條帶，符合G蛋白大小（見圖1）。表明RSV RNA已成功進(jìn)入A549細(xì)胞中，即RSV成功感染A549細(xì)胞。

2.2 不同病毒感染量對氣道上皮細(xì)胞MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 R1、R2、R3組和C組MUC5AC mRNA表達(dá)量分別為1.45±0.10、2.67±0.09、4.82± 0.27和1，蛋白表達(dá)量分別為（38.61±0.41）μg/L、（44.11±0.96）μg/L、（51.01±0.48）μg/L和（34.38± 0.95）μg/L，R1、R2、R3組MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性增加，與C組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A-B。

圖1 PCR產(chǎn)物驗證RSV成功感染A549細(xì)胞

2.3 Nar對A549細(xì)胞增殖-毒性影響 與對照組相比，Nar 400 μmol/L及800 μmol/L吸光度A值顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Nar 200 μmol/L組細(xì)胞存活率顯著下降，Nar 30～100 μmol/L組則對A549細(xì)胞的增殖活性無顯著影響。因此，選用Nar 30 μmol/L為低濃度組，Nar 100 μmol/L為高濃度組（見表1）。

表1 不同濃度Nar對A549細(xì)胞增殖-毒性影響（）

表1 不同濃度Nar對A549細(xì)胞增殖-毒性影響（）

與對照組比：aP＜0.05

組別吸光度A值細(xì)胞存活率（%）對照組1.58±0.06a100.00 Nar 30 μmol/L組1.57±0.07a98.28 Nar 50 μmol/L組1.54±0.09a93.10 Nar 80 μmol/L組1.52±0.06a89.66 Nar 100 μmol/L組1.47±0.07a81.03 Nar 200 μmol/L組1.25±0.05a43.10 Nar 400 μmol/L組1.12±0.13a20.69 Nar 800 μmol/L組1.03±0.14a5.17

2.4 Nar對RSV感染后氣道上皮細(xì)胞MUC5AC mRNA及蛋白水平的影響 與C組相比，R2組MUC5AC mRNA和蛋白水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。給予Nar 30 μmol/L及100 μmol/L干預(yù)后，RSV感染誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，N1、N2組較R2組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同時高濃度Nar干預(yù)效果較低濃度明顯。N3、N4組細(xì)胞MUC5AC mRNA及蛋白水平低于C組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2C-D。

2.5 熒光顯微鏡下各組細(xì)胞內(nèi)MUC5AC蛋白的表達(dá)水平 結(jié)果顯示：正常細(xì)胞可見少量MUC5AC蛋白（紅色）陽性染色，其主要在A549細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)也有少量表達(dá)（見圖3C）；未加一抗的陰性對照僅見DAPI染色的細(xì)胞核（藍(lán)色），幾乎見不到MUC5AC蛋白陽性染色（見圖3D）；RSV感染組可見細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)大量MUC5AC蛋白陽性染色（見圖3A）；Nar干預(yù)組與RSV感染組相比，MUC5AC蛋白熒光染色水平降低（見圖3B）。

圖2 各組MU5AC mRNA及蛋白的表達(dá)水平

圖3 熒光顯微鏡觀察MUC5AC在氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況（免疫熒光，×400）

3 討論

MUC作為黏液的主要組成部分，包含一大家族高分子量的糖蛋白，位于消化道、生殖道、中耳及氣管中。目前已確定的有20種MUC基因，其中MUC2、MUC5AC和MUC5B是和呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)的主要成分[9]，而MUC5AC是炎癥反應(yīng)時氣道黏蛋白增加的主要類型。已有研究證實RSV感染可導(dǎo)致MUC5AC表達(dá)上調(diào)。2003年Miller等[10]發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和黏液高度分泌是導(dǎo)致RSV感染后疾病重癥的因素之一。鮑一笑等[11]報道氣道上皮細(xì)胞在RSV感染時可出現(xiàn)黏蛋白表達(dá)增加，MUC5AC啟動子活性增加。然而，RSV不同病毒株對氣道炎癥和黏液分泌的影響并不一致，這也是每年RSV感染性疾病嚴(yán)重度不同的原因之一[12]。Mata等[13]證實RSV long株感染肺上皮A549細(xì)胞可誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)上調(diào)。Martin等[14]證實RSV19株感染BALB/c小鼠也會導(dǎo)致IL-13水平升高和氣道黏液的高分泌。

本研究采用實時熒光定量PCR及ELISA法檢測RSV A2株感染A549細(xì)胞后MUC5AC的mRNA及蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與C組相比，RSV感染組MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），不同的病毒感染量MUC5AC增加水平不同，RSV感染MOI=5.0組的MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平高于MOI=0.5組和MOI=1.0組。本研究還通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測MUC5AC蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSV感染組細(xì)胞胞漿內(nèi)大量MUC5AC蛋白陽性染色，核內(nèi)也有少量表達(dá)，而在正常細(xì)胞可見少量MUC5AC蛋白陽性染色，證實感染RSV A2株能引起氣道的黏液高分泌。

研究證實，Nar具有減輕氣道黏液高分泌的作用，可下調(diào)多種病理模型的MUC5AC高表達(dá)[4，15-16]。本研究通過CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測，選擇Nar 30 μmol/L為低濃度組，100 μmol/L為高濃度組，分別進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)水平均較RSV感染組（R2組）明顯降低。與低濃度組相比，高濃度組抑制MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)的作用更為顯著。本研究中DMSO組與C組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示實驗中終濃度的DMSO未對細(xì)胞造成損害。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果同時發(fā)現(xiàn)與RSV感染組相比，Nar干預(yù)組MUC5AC蛋白熒光染色水平明顯降低。以上結(jié)果表明，Nar可抑制MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴性。

綜上所述，感染RSV可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)水平增加，而Nar可下調(diào)MUC5AC mRNA及蛋白水平，具有抑制RSV感染引起的氣道黏液高分泌的作用。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Inhibition of Naringenin on mucous hypersecretion of A549 cell induced by A2 strain of respiratory syncytialvirus

MENG Shanshan1,2, LV Fangfang1, HU Xiaoguang1, ZHANG Hailin1, LI Changchong1. 1.Department of Paediatric Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Paediatrics, Zoucheng People’s Hospital, Jining, 273500

Objective: To investigate the expression levels of MUC5AC protein and mRNAin mucous hypersecretion model induced by respiratory syncytial virus (RSV), and explore the effect of Naringenin (Nar) on mucous hypersecretion induced by RSV. Methods: Human lung adenocarcinoma epithelial cells (A549) were subcultured, infected with RSV and treated with Nar 30-100 μmol/L. After it was treated for 24 hrs, the expression of MUC5AC at mRNA and protein level in the groups were determined by real-time quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The morphological changes of MUC5AC protein were observed with immunofuorescence technology. Results: The expressions of MUC5AC protein and mRNA in all RSV infected groups were signifcantly higher than that in group C in a dose-dependent manners (all P＜0.05). Nar of 30 and 100 μmol/Lsignifcantly and dose-dependently decreased RSV-induced secretion of MUC5AC protein in cell supernatant and expression of MUC5AC mRNA (P＜0.05), but still higher than that in group C (P＜0.05). We also observed that RSV increased MUC5AC protein expression in the cytoplasm of A549 by immunofuorescence technology, and the protein expression decreased after pretreatment with Nar. Conclusion: Naringenin can inhib-ite the RSV-induced mucous hypersecretion of A549 cell.

Naringenin; RSV; mucous hypersecretion; MUC5AC

R725.6

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.002

2015-03-18

衛(wèi)計委國家臨床重點專科開放基金資助項目（20130217）。

孟珊珊（1988-），女，山東泰安人，住院醫(yī)師。

張海鄰，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：zhlwz97@hotmail.com。