豬小腸黏膜下層與嗅鞘細胞生物相容性實驗

李玉安，李佳，徐華梓，林大木，吳志鵬

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 骨科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬第一醫院神經內科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

豬小腸黏膜下層與嗅鞘細胞生物相容性實驗

李玉安1，李佳2，徐華梓1，林大木1，吳志鵬1

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 骨科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬第一醫院神經內科，浙江 溫州 325015）

目的：探討以小腸黏膜下層（SIS）作為生物支架對嗅鞘細胞（OECs）增殖的生物相容性。方法：用Abraham法制取豬小腸黏膜下層，將小腸黏膜下層與純化的嗅鞘細胞復合培養作為實驗組，單純嗅鞘細胞培養作為對照組；定期進行倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡觀察細胞與材料的黏附生長情況，及CCK8增殖實驗定量檢測細胞增殖情況。結果：實驗組小腸黏膜下層與嗅鞘細胞復合培養后，倒置顯微鏡下可見嗅鞘細胞在24 h內即可貼壁生長；3～5 d后可見小腸黏膜下層邊緣嗅鞘細胞密集，黏附良好，形態以梭形細胞、三極細胞為主；不同時間點HE染色、電鏡下可見嗅鞘細胞與豬小腸黏膜下層附著緊密，細胞生長良好。CCK8細胞增殖定量檢測發現，實驗組細胞7～9 d后達平穩水平，11 d后略下降；前5 d實驗組細胞增殖能力低于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.05），培養至第7天2組細胞增殖能力差異無統計學意義（均P＞0.05）。結論：未發現小腸黏膜下層對嗅鞘細胞增殖有抑制作用，兩者間生物相容性良好，有望用作生物支架供嗅鞘細胞黏附生長。

嗅鞘細胞；小腸黏膜下層；支架；脊髓損傷

組織工程利用嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移植治療脊髓損傷成為近年來脊柱外科領域的研究熱點[1-5]，但由于缺乏理想的細胞移植支架材料，在體外及體內實驗中單純移植OECs卻未得到預期的效果；因此選擇合適的支架材料用以OECs移植以增強脊髓損傷修復效果是今后研究方向之一。小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）作為支架材料在修復組織缺損的實驗研究和臨床應用中取得滿意效果[6-8]，有一定臨床應用前景[9]。本實驗將體外分離培養的OECs與SIS復合培養并探討以小腸黏膜下層作為OECs移植支架材料的可能性。

1 材料和方法

1.1 SIS生物支架材料制備 參照Abraham法[10]取成年豬的新鮮近段空腸，沖洗后刮除黏膜層、漿膜層和肌層；進一步應用化學方法：①在含有乙二胺四乙酸（100 mmol/L）和氫氧化鈉（10 mmol/L）溶液（pH值11～12）中浸泡16 h；②用去離子水沖洗干凈，置于含鹽酸（1 mmol/L）和氯化鈉（1 mmol/ L）溶液（pH值0～1）中浸泡6～8 h；③用去離子水沖洗后在1 mmol/L氯化鈉磷酸緩沖液（PBS）中浸泡16 h；④用去離子水沖洗后在PBS溶液（pH值7～7.4）中浸泡2 h；⑤再用去離子水沖洗基質2 h；⑥殺菌：將SIS在含0.1%過氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.05%疊氮化鈉的PBS溶液清洗2 h，然后程序性降溫至-80 ℃，凍干后用γ射線照射（25～35 kGy）消毒，進行脫細胞和滅菌處理。

1.2 OECs的體外培養及鑒定 選取8～10周齡的成年SD大鼠，無菌條件下切取嗅球、剪碎，用含0.02% EDTA-0.25%胰蛋白酶消化15～20 min，再用含10%胎牛血清培養液終止消化。機械輕柔吹打20～30次，于水平離心機中以300 g離心5 min，去除上清液留沉淀物，加入含10%胎牛血清的DME/F12培養液，重懸成細胞懸液，調整細胞濃度為5×105/mL，然后采用18 h單次差速貼壁的方法純化培養嗅鞘細胞處理后OECs純度達70%～80%，10～12 d細胞長滿瓶底，消化后將細胞接種于玻片，使用神經生長因子受體P75（NGFRP75）和碘化丙啶（PI）雙重免疫熒光鑒定嗅鞘細胞[11-12]。

1.3 分組方法 實驗組為OECs與SIS的復合培養，將SIS剪成96孔板洞孔大小，平鋪于96孔板中，Hanks液浸泡24 h；取生長狀態良好的OECs細胞懸液100 μL，濃度為1×105/mL滴加于SIS表面，加培養液置于37 ℃、體積分數5% CO2恒溫培養箱中培養。對照組為單純嗅鞘細胞培養，直接將OECs懸液加于無SIS材料孔中進行培養，每組各有7對，每對各設6孔。

1.4 細胞觀察方法 ①每天于相差顯微鏡下觀察培養基有無混濁、細胞生長及與SIS材料附著的情況；②分別于OECs與SIS復合培養1、3、5、7、9、11、13 d后取出SIS，用D-Hanks液洗滌干凈后進行HE染色觀察；③OECs與SIS復合培養1、3、5、7、9、11、13 d后取出SIS，2%戊二醛固定2 h，再用1%鋨酸后固定2 h。乙醇梯度脫水，HITACHI E-1010型離子濺射儀中噴金，于HITACHI S-3000N掃描電鏡下觀察。

1.5 CCK8細胞增殖定量檢測 分別于OECs與SIS復合培養1、3、5、7、9、11、13 d后對2組進行CCK8細胞增殖定量檢測。實驗操作方法按照試劑盒（上海碧云天科技有限公司）的程序進行，用酶標儀于450 nm，參比波長600 nm下測定OD值。每個時間段各取6個孔樣本，檢測結果取平均值。

1.6 統計學處理方法 采用SPSS12.0統計軟件對數據進行分析。計量資料以表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察結果 實驗組18～24 h后可見大量雙極和三極細胞貼壁生長，也有少量多角扁平細胞生長；3～5 d后細胞突起進一步延長并開始連接成網狀結構。在SIS周邊區域細胞比較密集，黏附良好，多呈長梭形生長。7～9 d網孔更密集，出現部分區域1～2層細胞重疊生長。11～13 d細胞數量達至最大，出現接觸抑制現象。免疫熒光細胞化學反應鑒定其抗P75抗體呈陽性，見圖1。

2.2 HE染色觀察結果 實驗組1 d后行HE染色尚很難在SIS材料上發現細胞。將OECs與SIS復合培養3～5 d后，幾乎可以在SIS的任意區域發現OECs細胞，呈單層生長，與SIS黏附緊密。7～13 d時細胞進一步增多，部分區域細胞呈2～3層重疊生長，見圖2。

2.3 掃面電鏡觀察結果 OECs細胞在SIS表面生長旺盛，黏附良好，呈長梭、紡錘或長三角形，胞體立體感強，突起細長，連接成網或成束排列，部分細胞表面可見蛋白顆粒分泌。5～7 d后呈密集生長，突起聯系增多，網孔減小，連接成片，見圖3。

圖1 OECs與SIS復合培養3～5 d后OECs增殖明顯，細胞突起進一步延長并開始連接成網狀結構（×200）

圖2 OECs與SIS復合培養7～13 d，OECs進一步增殖，部分區域細胞呈2～3層重疊生長（×400）

圖3 OECs細胞與SIS復合培養7 d呈密集生長，突起聯系增多，網孔減小，連接成片，細胞表面可見蛋白分泌顆粒（×400）

2.4 CCK8細胞增殖定量檢測結果 OECs與SIS復合培養后增殖良好，細胞總量隨著時間延長逐漸增高，第7天后細胞數量即達較高水平，11 d時達頂峰，隨后開始下降。OD值第1天（1.38±0.10）逐漸增加至第11天（2.65±0.20）。OECs組增殖趨勢與復合培養基本一致。第1、第3、第5天對照組OD值比實驗組高，差異有統計學意義（均P＜0.05）；第7、第9、第11、第13天2組間差異無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 CCK8細胞增殖定量檢測結果（OD值，n=6，）

表1 CCK8細胞增殖定量檢測結果（OD值，n=6，）

天數實驗組對照組tP 11.38±0.101.72±0.047.783＜0.001 31.87±0.092.51±0.265.740＜0.001 52.40±0.102.63±0.143.2910.008 72.49±0.322.60±0.120.7790.454 92.61±0.322.71±0.150.7380.478 112.65±0.202.68±0.240.1850.857 132.48±0.562.38±0.460.3270.750

3 討論

隨著對OECs研究的逐漸深入以及OECs移植治療脊髓損傷動物實驗的廣泛開展，近年來國內外已經陸續開展了利用OECs移植治療脊髓損傷的人體臨床試驗，但是令人感到遺憾的是這些臨床試驗在療效上未達到預期[14-16]。因此我們需要在OECs移植同時求助于其他的他輔助手段。研究[17-18]表明，脊髓損傷后局部常形成膠質瘢痕與較大的空洞，單獨OECs移植后細胞在瘢痕空洞中缺乏細胞外基質的支持作用，細胞在空洞中缺乏可以黏附生長的支架，細胞因子與細胞外基質的分泌亦難以在局部聚集以形成有利于細胞生存的微環境。因此合適的支架材料也是修復脊髓損傷的關鍵。

SIS是一種不含細胞的天然細胞外基質生物材料，主要由I型膠原和 III型膠原纖維組成，含有少量的V型和VI型膠原纖維，組成上接近于天然結締組織的成分，是一種理想的支架材料。很多的體外實驗[7-8，19-21]都證實了SIS：①有良好的組織相容性；②可降解性和降解速率可控性；③無抗原作用；④維持細胞形態和表型，并增進細胞的黏附和生殖，誘導組織再生；⑤有一定孔隙率；⑥有一定機械強度。另外SIS已經在修復下尿路、膀胱、血管、肌腱、韌帶、骨、半月板等多種組織缺損的實驗和臨床應用研究中取得了良好的效果。

本實驗在體外將SD大鼠嗅球OECs與豬SIS進行復合培養，通過倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察，可以發現OECs在SIS表面生長旺盛，增殖迅速，兩者之間黏附緊密。同正常培養的OECs相比，與SIS復合培養的OECs雖在早期生長稍弱，但在后期增殖迅速，數量上差異無統計學意義；通過CCK8細胞增殖定量檢測發現OECs和SIS復合培養與正常培養的OECs相比在細胞增殖方面，1～5 d時兩者增殖程度差異有統計學意義，其中OECs與SIS復合組稍弱，但7 d后兩者的細胞增殖程度的差異就已經無統計學意義了。7 d對于嗅鞘細胞來講尚處于對數生長期，而臨床上獲取細胞通常在這個階段或之后，因此在獲取細胞時兩者差異無統計學意義，因此本實驗雖未發現SIS對OECs有促增殖作用，但在SIS材料上復合培養的OECs在形態上與正常培養的OECs相同，生長旺盛，且在培養中后期（5～7 d后）與正常培養的OECs數量上差異無統計學意義，較為客觀地說明了SIS與OECs具有良好相容性。SIS作為支架材料，在進行細胞移植獲取細胞的時候，生長于SIS上的OECs可以同SIS一起取下，避免了酶的消化對細胞的損傷。更為重要的一點是，SIS作為OECs的生長支架，隨著OECs一起進行移植進入體內時，等同于給OECs營造了一個熟悉的生長環境，更有利于移植的OECs存活，使其發揮強大的修復脊髓損傷的功能。另外SIS對脊髓空洞的填充作用，避免了細胞的懸浮及流失，進一步促進了OECs功能的發揮。

[1] Kubasak MD, Jindrich DL, Zhong H, et al. OEG implantation and step training enhance hindlimb-stepping ability in adult spinal transected rats[J]. Brain, 2008, 131(Pt 1): 264-276.

[2] Vavrek R, Pearse DD, Fouad K. Neuronal populations capable of regeneration following a combined treatment in rats with spinal cord transection[J]. J Neurotrauma, 2007, 24 (10): 1667-1673.

[3] Franssen EH, de Bree FM, Verhaagen J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord[J]. Brain Res Rev, 2007, 56(1): 236-258.

[4] Li Y, Chen L, Zhao Y, et al. Intracranial transplant of olfactory ensheathing cells can protect both upper and lower motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis[J]. Cell Transplant, 2013, 22(Suppl 1): S51-S65.

[5] Lokanathan Y, Ng MH, Hasan S, et al. Olfactory ensheathing cells seeded muscle-stuffed vein as nerve conduit for peripheral nerve repair: a nerve conduction study[J]. J Biosci Bioeng, 2014, 118(2): 231-234.

[6] Rajaian S, Rajadoss MP, Nayak S, et al. Traumatic rectourethral fstula repair: A potential application of porcine small intestinal submucosa[J]. Indian J Urol, 2013, 29(2): 148-150.

[7] Greca FH, de Noronha L, Marcolini FR, et al. Small intestinal submucosa as a graft to increase rectum diameter[J]. J Surg Res, 2013, 183(2): 503-508.

[8] Schaefer M, Kaiser A, Stehr M, et al. Bladder augmentation with small intestinal submucosa leads to unsatisfactory longterm results[J]. J Pediatr Urol, 2013, 9(6 Pt A): 878-883.

[9] Lin HK, Godiwalla SY, Palmer B, et al. Understanding roles of porcine small intestinal submucosa in urinary bladder regeneration: identification of variable regenerative characteristics of small intestinal submucosa[J]. Tissue Eng Part B Rev, 2014, 20(1): 73-83.

[10] Abraham GA, Murray J, Billiar K, et al. Evaluation of the porcine intestinal collagen layer as a biomaterial[J]. J Biomed Mater Res, 2000, 51(3): 442-452.

[11] Nash HH, Borke RC, Anders JJ. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb[J]. Glia, 2001, 34(2): 81-87.

[12] 李玉安, 徐華梓, 李萬里. 單次差速貼壁法純化培養大鼠嗅神經鞘細胞的實驗研究[J]. 實用醫學雜志, 2009, 25(10): 1562-1565.

[13] 蘇琰, 張長青, 張開剛, 等. 小腸黏膜下層與雪旺細胞生物相容性的研究[J]. 中華創傷骨科雜志, 2007, 9(2): 153-156.

[14] Féron F, Perry C, Cochrane J, et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human spinal cord injury[J]. Brain, 2005, 128(Pt 12): 2951-2960.

[15] Lima C, Pratas-Vital J, Escada P, et al. Olfactory mucosa autografts in human spinal cord injury: a pilot clinical study[J]. J Spinal Cord Med, 2006, 29(3): 191-203.

[16] Mackay-Sim A, Féron F, Cochrane J, et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial[J]. Brain, 2008, 131(Pt 9): 2376-2386.

[17] Maikos JT, Qian Z, Metaxas D, et al. Finite element analysis of spinal cord injury in the rat[J]. J Neurotrauma, 2008, 25 (7): 795-816.

[18] Kwon BK, Fisher CG, Dvorak MF, et al. Strategies to promote neural repair and regeneration after spinal cord injury [J]. Spine (Phila Pa 1976), 2005, 30(17 Suppl): S3-S13.

[19] Mantovani F, Trinchieri A, Mangiarotti B, et al. Reconstructive urethroplasty using porcine acellular matrix: preliminary results[J]. Arch Ital Urol Androl, 2002, 74(3): 127-128.

[20] Sclamberg SG, Tibone JE, Itamura JM, et al. Six-month magnetic resonance imaging follow-up of large and massive rotator cuff repairs reinforced with porcine small intestinal submucosa[J]. J Shoulder Elbow Surg, 2004, 13(5): 538-541.

[21] Lu SH, Sacks MS, Chung SY, et al. Biaxial mechanical properties of muscle-derived cell seeded small intestinal submucosa for bladder wall reconstitution[J]. Biomaterials, 2005, 26(4): 443-449.

（本文編輯：吳彬）

Biocompatibility experiment of small intestinal submucosa with olfactory ensheathing cells

LI Yu’an1, LI Jia2, XU Huazi1, LIN Damu1, WU Zhipeng1. 1.Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the biocompatibility of small intestinal submucosa as a biological scaffold on the proliferation of olfactory ensheathing cells. Methods: The porcine small intestinal submucosa (SIS) was made according to Abraham’s methods. seeding the OECs on the porcine SIS for experimental group (SIS+OECs), OECs cultivating alone as control group. Then OECs’ growth, adhesion and proliferation of OECs on SIS was examined by HE stained and scanning electron microscope at different time during the cultivation, and the proliferation of OECs was examined with CCK8 as well. Results: OECs could attach to SIS within 24 hours after seeded on the SIS. After being cultured 3 to 5 days, OECs were intensive on the edge of SIS, well adhered to it and the cells were most fusiform and tripolar in shape. The combination of SIS and OECs was very excellently examinated by scanning electron microscope and Haematoxylin and eosin stained. And CCK8 measurement also revealed that, the quantity of OECs reached a stable level at 7 to 9 day and this level would not decreased until 11 d. Compared with these in contrast group, the proliferation of OECs on SIS had obvious difference during the former 5 days (P＜0.05) but there was no signifcant difference after 7 day (P＞0.05). Conclusion: Porcine SIS has good biocompatibility with rat OECs, although there is no evidence showing SIS promoting OECs’ proliferation. SIS can expectedly be used in repair of spinal cord injury as a scaffold where OECs may grow and adhere.

olfactory ensheathing cells; small submucosa intestinal; scaffold; spinal cord injury

R318.19

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.007

2014-07-31

溫州市科技局對外合作項目（H20080031）。

李玉安（1983-），男，浙江溫州人，碩士。

徐華梓，教授，主任醫師，博士生導師，Email：spine xu@163.com。