直乙交界處腸癌患者KRAS和BRAF基因突變138例分析

楊帆，蔡業(yè)豐，金浪平，張筱驊，瞿金妙

（1.溫州醫(yī)科大學 研究生院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江溫州 325015）

·論 著·

直乙交界處腸癌患者KRAS和BRAF基因突變138例分析

楊帆1，蔡業(yè)豐1，金浪平1，張筱驊2，瞿金妙2

（1.溫州醫(yī)科大學 研究生院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江溫州 325015）

目的：檢測直乙交界處腸癌患者KRAS和BRAF基因的突變特征，分析KRAS和BRAF突變與患者臨床病理特征的相關性及其臨床意義。方法：收集138例直乙交界處腸癌患者的腫瘤組織，運用直接測序法檢測組織標本中KRAS基因外顯子2第12、第13位密碼子，外顯子3第61位密碼子以及BRAF基因外顯子15的突變狀態(tài)，分析該2個基因突變與臨床病理特征的相關性。結果：138例樣本中，KRAS和BRAF的突變率為34.05%（47/138）和5.07%（7/138）。KRAS基因有9種突變類型，其中包括1種全新的突變類型。BRAF基因全為V600E突變。在直乙交界處腸癌患者中，KRAS基因在男性（P=0.041）、遠處轉移（P=0.002）、高臨床分期（P=0.047）的患者中突變率更高，BRAF基因突變更常見于腫瘤多發(fā)（P=0.003）、低分化（P＜0.001）的患者中，KRAS和BRAF與年齡、腫塊大小、腫瘤病理形態(tài)、病理類型、浸潤深度、淋巴結轉移、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤等臨床病理特征均無顯著相關性。結論：直乙交界處腸癌有它的特殊性，KRAS基因在男性、遠處轉移、臨床分期晚期的患者中突變率更高，BRAF基因在多發(fā)、低分化的患者中突變率更高。KRAS、BRAF基因在不同部位的結直腸癌中改變情況并不一致。

直乙交界；腸腫瘤；臨床病理特征；KRAS基因；BRAF基因

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤。根據(jù)全國腫瘤登記中心的數(shù)據(jù)，2009年中國結直腸癌發(fā)病率為29.44/10萬，病死率為14.23/10萬，結直腸癌新發(fā)病例占全部惡性腫瘤的10.30%，死亡病例則占7.88%[1]。目前研究認為結直腸癌是一類分子水平上高度異質性的疾病，患者之間的遺傳背景、基因分型以及治療的敏感性等方面存在較大的個體差異。KRAS和BRAF基因是現(xiàn)在結直腸癌中研究的熱點，這些基因在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，并可以指導患者的個體化診療過程[2-4]。目前研究已經(jīng)報道不同部位的結直腸癌中KRAS、BRAF突變率存在差異[5-6]，然而還缺乏對于直乙交界處腸癌的KRAS和BRAF突變情況的研究。該處腫瘤國內報道較少，但臨床上并不少見。因此我們回顧性地分析了138例直乙交界處腸癌患者中KRAS、BRAF基因突變發(fā)生率、突變特征及其與臨床病理特征的關系，旨在探討KRAS和BRAF基因在直乙交界處腸癌發(fā)生中的作用，研究其突變的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2000年1月至2013年12月期間于我院住院治療的結直腸癌患者。納入標準：①術后病理報告確診為結直腸癌；②結直腸癌術中及術后病理明確腫瘤位于直乙交界處；③在我院經(jīng)過完整規(guī)范化治療的結直腸癌患者。排除標準：①存在其他部位腫瘤的多原發(fā)腫瘤；②其他組織來源的腫瘤，如黑色素瘤、淋巴瘤等；③隨訪資料不完整者。詳細記錄符合標準的患者性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、大小、病理類型、病理形態(tài)、分化程度、臨床分期、Duke分期、癌結節(jié)、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤、遠處轉移等臨床病理資料。所有標本均為甲醛固定，石蠟包埋組織。腫瘤分期采用AJCC標準，所有患者的臨床病理資料見表1。

表1 直乙交界處腸癌患者臨床病理特征分析（n=138）

續(xù)表1

1.2 基因組DNA提取 按DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini-Kit，QIAGEN）說明書提取石蠟標本基因組DNA。

1.3 PCR擴增 根據(jù)KRAS、BRAF基因組DNA序列設計PCR引物，引物序列見表2，引物由浙江迪諾基因科技有限公司合成。每個反應體系50 μL，其中包括10×PCR緩沖液5 μL，0.1 mol/L氯化鎂1.5 μL，25 mmol/L dNTP mix 2.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，10 μL rTaqDNA聚合酶，2 μL DNA模板，ddH2O 28 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)45次，最后72 ℃延伸4 min，每次反應均設置陽性及陰性對照，完成整個循環(huán)。將PCR擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳以鑒定PCR產(chǎn)物純度。

表2 KRAS、BRAF基因PCR擴增與直接測序引物序列

1.4 DNA測序 送由浙江迪諾基因科技有限公司進行測序，所有病例均做KRAS基因第2、第3號外顯子和BRAF基因第15號外顯子突變檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。對不同組別的突變率行x2值/t值檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KRAS基因突變特征 138例直乙交界處腸癌中有47例檢出KRAS基因突變，其中KRAS基因12、13、61位密碼子突變率分別為22.46%（31/138），9.42%（13/138），1.44%（2/138），以及1例（1/138）全新的突變（見表3）。12密碼子共檢測到5種突變類型：GGT＞TGT（G12C），GGT＞GTT（G12V），GGT＞GAT（G12D），GGT＞GCT（G12A），GGT＞AGT（G12S）。13密碼子檢測到1種突變類型：GGC＞GAC（G13D）。61密碼子檢測到2種突變類型：CAA＞CTA（Q61L），CAA＞CAC（Q61H）（見圖1）。此外，我們發(fā)現(xiàn)了1例全新的突變，該突變導致第12密碼子第2、第3三個堿基間發(fā)生6 bp插入突變，插入堿基為AGCTGG，這種全新的突變導致第12和第13密碼子間插入2個氨基酸（見圖2）。

表3 KRAS與BRAF基因突變類型

2.2 BRAF基因突變特征 138例直乙交界處腸癌中有7例BRAF基因突變，突變率為5.07%（7/138），均為V600E突變。未發(fā)現(xiàn)同時存在KRAS和BRAF基因突變的患者，KRAS突變和BRAFV600E突變相互排斥。

2.3 KRAS及BRAF基因突變與結直腸癌臨床病理特征的關系 KRAS基因在男性（P=0.041）、遠處轉移（P=0.002）、高臨床分期（P=0.047）的患者中突變率更高，與年齡、腫塊大小、腫瘤病理形態(tài)、腫瘤分化情況、病理類型、浸潤深度、淋巴結轉移、多發(fā)、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤等臨床病理特征均無顯著相關性（P＞0.05）。BRAF基因突變更常見于多發(fā)（P=0.003）、低分化（P＜0.001）的患者中，而與性別、年齡、腫塊大小、病理形態(tài)、病理類型等臨床病理特征無相關性。見表4。

3 討論

圖1 KRAS、BRAF基因突變測序峰圖

圖2 全新的KRAS基因突變

結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個受多基因、多步驟調控的復雜過程。作為表皮生長因子受體（EGFR）信號轉導通路下游的重要癌基因，KRAS基因在細胞的生長以及血管生成中發(fā)揮了重要調控作用[7-8]。2011年發(fā)布的美國《國家綜合癌癥網(wǎng)絡結直腸癌臨床實踐指南（NCCN）》明確提出將KRAS基因狀態(tài)作為是否對結直腸癌患者使用抗EGFR單抗治療的標準。野生型KRAS基因需要在上游EGFR信號刺激下通過信號轉導通路發(fā)揮調控作用，而突變型KRAS基因無需依賴其上游的EGFR信號刺激就可以通過自身磷酸化持續(xù)激活下游信號轉導通路。因此抗EGFR藥物對KRAS基因突變的結直腸癌患者無效[9-10]。目前報道的KRAS突變率、突變類型有一定差別。高靜等[5]報道國內966例標本中，結腸癌患者發(fā)生KRAS突變的頻率（為41%）高于直腸癌患者（為34.9%），并指出右半結腸癌患者發(fā)生KRAS突變與BRAF突變的頻率明顯高于左半結腸癌或直腸癌患者，同時他們發(fā)現(xiàn)KRAS基因在女性中的突變率較高。而朱曉麗等[6]分析了557例標本發(fā)現(xiàn)，左半結腸癌KRAS突變率為36.3%，要低于直腸癌的42.2%，并提示KRAS突變率與女性、腫瘤部位相關。而我們測得直乙交界處腸癌的KRAS突變率為34%，可見現(xiàn)在報道結直腸癌在不同部位的KRAS突變率并不一致。我們在直乙交界處發(fā)現(xiàn)一種全新的KRAS突變，該突變導致在第12和第13密碼子間插入了2個氨基酸。目前國內鮮有此種新突變的臨床研究報道，因此我們推測這種突變是在直乙交界處腸癌所特有的。同時我們發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變在男性、遠處轉移、臨床分期晚期的患者中突變率更高，而與年齡、腫塊大小、腫瘤病理形態(tài)、腫瘤分化情況、病理類型、浸潤深度、淋巴結轉移、多發(fā)、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤等臨床病理特征無相關性，而具體機制仍不明確，有待進一步研究。鑒于在遠處轉移和臨床晚期的患者中KRAS突變率較高，在這些患者中開展KRAS基因篩選工作，可能具有更為重要的臨床意義。

有研究報道部分KRAS基因野生型患者對抗EGFR單抗治療無效，而BRAF基因突變是導致這一部分結直腸癌患者產(chǎn)生耐藥反應的原因[11-13]。現(xiàn)在各家報道BRAF基因在結直腸癌患者中突變率較低，沈胤晨等[14]檢測了676例結直腸癌患者中，直腸癌的BRAFV600E突變率為1．03%，乙狀結腸癌的突變率為1.87%，而直乙交界處的突變率為0，并指出腫瘤分化程度越低，BRAF突變率越高。而曹祥龍等[15]報告BRAFV600E突變率為5.7%，更常見于老年（＞65歲）、（脾區(qū)）近端結腸、無遠處轉移的患者。我們測得直乙交界處腸癌的BRAF突變率為5.07%，并且BRAF基因突變的患者多伴有多發(fā)病灶，且原發(fā)病灶呈低分化，而與性別、年齡、腫塊大小、病理形態(tài)、分化情況、病理類型、浸潤深度、臨床分期等臨床病理特征無相關性。隨著腫瘤分化程度的降低，腫瘤遠處轉移的潛能上升，因此對于BRAF突變的患者，臨床上應該更加關注其是否存在病灶轉移和多發(fā)的情況。BRAF基因有望成為預測抗EGFR單抗治療新的療效指標。

表4 KRAF和BRAF基因突變與直乙交界處腸癌患者臨床病理特征的相關性[n（%），]

表4 KRAF和BRAF基因突變與直乙交界處腸癌患者臨床病理特征的相關性[n（%），]

臨床病理資料例數(shù)KRAS基因BRAF基因野生型突變型x2/tP野生型突變型x2/tP性別 4.1650.04101男9356（60）37（40） 88（95）5（5）女4535（77）10（23）43（96）2（4）年齡（歲）13863.150±10.14065.702±10.518 1.3810.17063.67±10.2870.571±9.034 1.7380.084腫塊大小（cm）1384.401±1.7034.353±1.260-0.1870.8524.397±1.5514.142±1.864-0.4190.676腫瘤病理形態(tài) 0.3090.643 0.6420.351潰瘍型11474（65）40（35）109（96）5（4）隆起型2417（70） 7（30）22（92）2（8）腫瘤分化情況 1.0280.58533.143＜0.001低分化5 4（80） 1（20）2（40） 3（60）中分化10671（67）35（33）102（96）4（4）高分化2716（59）11（41）27（100）0（0）病理類型 2.2190.373 3.3970.267管狀腺癌4530（66）15（34）43（96）2（4）腺癌8957（64）32（36）85（96）4（4）黏液腺癌4 4（100）0（0）3（75） 1（25）浸潤深度 0.4710.656 0.0001.000 T1-T22820（71） 8（29）27（96）1（4）T3-T411071（65）39（35）104（95）6（5）淋巴結轉移 0.9220.362 0.0431.000有5433（61）21（39）51（94）3（6）無8458（69）26（31）80（95）4（5）N分期 2.1720.350 1.0730.616 NO8458（69）26（31）80（95）4（5）N13825（66）13（34）35（92）3（8）N216 8（50） 8（50）16（100）0（0）遠處轉移 9.9710.002 1.1790.593無11884（71）34（29）113（96）5（4）有20 7（35）13（65）18（90） 2（10）Dukes分期 2.8000.104 0.0001.000 A-B8158（72）23（28）77（95）4（5）C-D5733（58）24（42）54（97）3（3）臨床分期 7.9000.047 1.4530.722 I 2318（78） 5（22）21（95）1（5）II 5839（67）19（33）56（95）3（5）III 3726（70）11（30）36（97）1（3）IV20 8（40）12（60）18（90） 2（10）多發(fā) 0.0431.000 8.8250.003是2818（64）10（36）23（82） 5（18）否11073（66）37（34）108（98）2（2）

續(xù)表4

直腸乙狀結腸交界處位于第3骶椎前方，該處乙狀結腸以近90°與直腸相連接，是整個結腸最狹窄的部位[16]。雖然此處的腸癌國內外報道較少，但臨床上并不少見。國內幾項大樣本的研究報告直乙交界處結腸癌發(fā)生率占全部結直腸癌的2.2%～3.4%[17-18]。在回顧性收集2000年至2013年于我院行結直腸癌手術的3 280例患者中，我們發(fā)現(xiàn)了138例直乙交界處腸癌的患者，約占全部結直腸癌的4.2%，與之前報道基本一致。現(xiàn)在對于直乙交界處腸癌應該歸屬為結腸癌還是直腸癌，學界還存在爭議[19]。直乙交界處腸癌發(fā)生于乙狀結腸處的螺旋形黏膜上，從解剖上看屬于結腸。但在腹膜折返處直乙交界處和直腸共用一套血管系統(tǒng)，因此也有學者認為該處腫瘤應該歸屬于直腸腫瘤。國內文獻報道直乙交界處腸癌的X線檢查極易漏診、誤診。而內鏡則把乙狀結腸的螺旋形黏膜皺折作為分界線，其下方黏膜緊貼腸壁為直腸，其上方為乙狀結腸。因其位置距肛門約15 cm以上，指診多不能觸及[20]。直乙交界處腸癌臨床表現(xiàn)多無特異性，早期多表現(xiàn)為排便習慣與糞便性狀改變?yōu)橹鳌Ｍ砥诳沙霈F(xiàn)腸梗阻癥狀以及貧血、乏力、消瘦等全身癥狀。因此，該處的腫瘤早期診斷率較低。直乙交界處腸癌相對結、直腸腫瘤而言，發(fā)生腸梗阻的概率更高、手術切除率較低，因而直乙交界處腸癌具有它的特殊性。目前鮮有關于此處的腸癌與直腸癌、結腸癌預后及生存率有無差異的報道。

綜上所述，本研究檢測了138例直乙交界處腸癌患者中KRAS與BRAF基因突變狀態(tài)，突變率分別為34.05%與5.07%，并發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變與性別、遠處轉移、臨床分期相關，而BRAF基因突變在多發(fā)、低分化的患者中更常見。同時我們發(fā)現(xiàn)了一種全新的KRAS基因突變類型。現(xiàn)在各家報道的KRAS、BRAF基因狀態(tài)在不同部位的結直腸癌中改變情況并不一致。本研究針對直乙交界處的腸癌進行KRAS和BRAF基因的突變情況進行分析，而KRAS和BRAF基因在直乙交界處腸癌發(fā)生中的作用和機制有待于進一步研究。

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（本文編輯：胡苗苗）

Clinicopathological characteristics of KRAS and BRAF mutation in 138 patients with rectosigmoid can-cer

YANG Fan1, CAI Yefeng1, JIN Langping1, ZHANG Xiaohua2, QU Jinmiao2. 1.Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Surgical Oncology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To identify the mutation rate and mutation feature of KRAS and BRAF gene in patients with rectosigmoid carcinoma, to analyse the association between KRAS/BRAF mutations and patients’clinicopathological characteristics, and discuss the clinical signifcance of KRAS/BRAF mutations. Methods: 138 patients with rectosigmoid carcinoma were collected. DNA sequencing was used to detect mutations in KRAS (codons12, 13 of exon2 and codons 61 of exon3) and BRAF (exon15). Statistically analyzing the relationships between gene mutations and clinicopathological characteristic. Results: In 138 cases, the mutation rate of KRAS and BRAF was 34.05% (47/138) and 5.07% (7/138). 9 mutation types were found in KRAS, including a new mutation type. BRAF mutation was all belong to V600E mutation. In patients with rectosigmoid carcinoma, KRAS mutation rate was higher in male (P=0.041), distant metastasis (P=0.002) and high clinical stages (P=0.047). BRAF mutation rate was higher in multiple (P=0.003) and poorly differentiate (P=0.001) carcinoma. No signifcant associations were observed between KRAS/BRAF mutations and age, tumor size, pathomorphism, pathological type, depth of invasion, lymph node metastasis, vessel infltration and nervous infltration (P＞0.05). Conclusion: Rectosigmoid carcinoma is unique. KRAS mutation rate is higher in male, distant metastasis and high clinical stages carcinoma. BRAF mutation rate is higher in multiple and poorly differentiate carcinoma. KRAS and BRAF mutations are variant in different location of colorectal cancer.

rectosigmoid; intestinal neoplasms; clinicopathological characteristic; KRAS gene; BRAF gene

R735.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.005

2014-12-22

溫州市科技計劃資助項目（Y20140132）。

楊帆（1991-），男，浙江溫州人，碩士生。

瞿金妙，副主任醫(yī)師，Email：Oncologist_qjm@sina. com。