漢族男性注意缺陷多動障礙兒童執行功能與單胺氧化酶A基因活性相關分析

王維千，杜松妹，楊闖，陳宏，趙永忠，梁艷，林海西，張曉燕，王常綠，王美豪，何金彩

（溫州醫科大學附屬第一醫院 精神衛生科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

漢族男性注意缺陷多動障礙兒童執行功能與單胺氧化酶A基因活性相關分析

王維千，杜松妹，楊闖，陳宏，趙永忠，梁艷，林海西，張曉燕，王常綠，王美豪，何金彩

（溫州醫科大學附屬第一醫院 精神衛生科，浙江 溫州 325015）

目的：探討單胺氧化酶A（MAOA）基因活性與注意缺陷多動障礙（ADHD）執行功能的關系。方法：采用威斯康星分類測驗和Stroop詞色干擾測試對37例ADHD漢族兒童與30名正常對照組進行執行功能評估，采集外周全血并應用限制性片段長度多態性的方法檢測MAOA基因啟動子30 bp可變數目串聯重復倍數，根據重復倍數分別將ADHD組和對照組分為高活性組與低活性組。結果：組別因素對WSCT概念化水平、完成分類數、錯誤應答數、持續錯誤數、持續應答數的影響差異均有統計學意義（P＜0.05）；2組間對Stroop色詞測驗中完成卡片A和卡片C的耗時數差異有統計學意義（P＜0.001），干擾效應的耗時數差異有統計學意義（P＜O.05）；基因活性分組因素對WSCT概念化水平、持續錯誤數、錯誤應答數的影響差異有統計學意義（P＜O.05），對Stroop色詞測驗中的完成卡片A和卡片C的耗時數差異有統計學意義（P＜0.05），干擾效應的耗時數差異有統計學意義（P＜O.05）；ADHD組和正常對照組間MAOA等位基因的分布差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：本研究未發現MAOA-uVNTR各等位基因分布與ADHD存在關聯，但可能與ADHD兒童部分執行功能有一定相關性。

注意缺陷多動障礙；單胺氧化A基因多態性；執行功能；Stroop詞色干擾測試；威斯康辛分類卡片測驗

遺傳學研究發現單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAOA）基因與注意缺陷多動障礙（attentiondeficit hyperactivity disorder，ADHD）的發病有一定的關系，尤其與沖動、攻擊等行為相關性更明顯。MAOA是多巴胺（dopamine，DA）、五羥色胺（hydroxytry-ptamine，5-HT）和去甲腎上腺素（norepi-nephrine，NE）的重要代謝酶，而這些神經遞質影響認知功能[1]。已發現MAOA基因多態性（MAOA-uVNTR）與反應抑制功能、記憶功能[2]、工作記憶、視覺空間工作記憶功能[3]、啟動功能[4]有關；基因影像學研究發現攜帶低活性基因的人群比攜帶高活性基因人群在右背側前額葉皮質調控能力強；同時發現攜帶高活性基因人群與攜帶低活性基因的人群比較調控情感相關區域能力強，而調節認知功能相關區域差[5]。ADHD兒童執行功能損害與額葉-基底節功能減低有關[6]，MAOA基因主要分布在中樞兒茶酚胺能神經元，研究發現個體的認知能力受到前額葉兒茶酚胺能神經遞質釋放水平的顯著影響[7]。我們推測MAOA基因活性可能與ADHD患者認知功能有關，執行功能是ADHD研究過程中較為關注的認知功能之一；目前針對中國漢族兒童的有關MAOA基因活性與ADHD兒童執行功能的相關性研究鮮見有公開報道。本研究通過比較中國漢族ADHD患兒與正常對照組執行功能的差異，探討MAOA基因活性與ADHD患兒執行功能的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2013年6月至2014年1月在溫州醫科大學附屬第一醫院兒童心理科門診就診的ADHD患者共37例，男，漢族，年齡7～12歲，經精神科醫師（2名主治或主治醫師以上職稱醫師）確診作為ADHD組。入組標準：①符合美國精神障礙與統計手冊第5版中ADHD診斷標準；②韋氏智力測驗智力商數IQ≥90；③右利手；④未經任何藥物治療；⑤排除兒童精神分裂癥、情感障礙、精神發育遲滯和發育障礙等疾病，無精神疾病家族遺傳史；⑥排除共患對立違拗性障礙或品行障礙、學習困難、抽動障礙等病例。選自社區和學校招募的健康兒童，男，漢族，年齡7～12歲，右利手，排除各種神經精神疾病，共30例，作為對照組。所有兒童均為右利手，視力或矯正視力正常，無學習困難及語言障礙。2組間年齡、全量表智商、言語智商、操作智商比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。本研究經溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準，2組受試者均獲得監護人知情同意并簽署知情同意書。

表1 ADHD組與正常對照組的人口學資料比較（）

表1 ADHD組與正常對照組的人口學資料比較（）

變量ADHD組（n=37）正常對照組（n=30）tP年齡（歲） 8.41±0.430 8.46±0.51-0.200.985言語智商127．67±16.25128.87±18.71-0.190.845操作智商105.89±10.19105.20±16.16-0.150.883總智商119.28±11.71120.20±17.56-0.180.858

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和基因分型：采集被試兒童外周靜脈血5 mL，收集DNA樣本。PCR試劑：KAPA2G Fast Multiplex Mix（Code NO.：KM5802）購自北京天根生化科技有限公司，產品批號[DP304]提取DNA，并在-70 ℃保存。目的基因擴增及基因型鑒定：PCR擴增循環為25 μL反應體系，基因組DNA 1 μL；上下游引物各1 μL，2×GOTaq Green Master Mix（華大科技合成公司）12.5 μL，去離子水9.5 μL。MAOA引物上游：5’-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3’，下游：5’-GA ACGGACGCTCCATTCGGA-3’。所有PCR都在Gene Amp PCR 2 400系統上完成。PCR擴增循環條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（共30個循環），最后72 ℃延伸5 min，-20 ℃保存待檢。取上述基因產物用DuRed染色，1.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，用1 600 Gel Image System成像系統照相，讀取基因型。片段大小：183 bp為2次重復（2R），213 bp為3次重復（3R），244 bp為4次重復（4R），272 bp為5次重復（5R），并記錄結果。

1.2.2 韋氏智力檢查：采用龔耀先1993年版的中國韋氏兒童智力量表[8]（C-WISC）評定ADHD患兒的智商，分別計算言語智商、操作智商和總智商。

1.2.3 威斯康辛分類卡片測驗（wisconsin-sorting test，WCST）[9]：受試者完成分類并將128張卡片分類，計算機軟件自動分析得出測試結果，進行測試時采用統一的指導語，分別記錄持續錯誤數（Rpe）、錯誤應答數（Re）、概念化水平（Rfp）、完成分類數（CC）和持續應答數（Rp）；其中CC與轉換能力有關，Re主要與抽象概括能力及執行功能有關，Rfp與概念形成及運用能力有關，Rpe與持續性操作能力有關，Rp與任務管理能力有關。

1.2.4 Stroop色詞測驗[10]：本測驗共分3步，3張卡片，每張24個字，由紅、綠、黃、藍4種顏色組成。

第一步呈現A卡片，由4種顏色的圓點（紅、綠、黃、藍）組成，要求快速且準確地讀出，并記錄耗時數（s）。第二步呈現B卡片，由紅、綠、黃、藍4種顏色的漢字組成，要求快速且準確地讀出漢字顏色，并記錄耗時數（s）。第三步呈現C卡片，將4種表示顏色的漢字（紅、綠、黃、藍）用4種不同的顏色呈現，要求快速且準確地讀出字的顏色，而非漢字的意義，并記錄耗時數（s）。干擾效應=C卡片的耗時數-A卡片的耗時數；記錄主要指標：干擾效應和各耗時數，測試ADHD兒童干擾抑制能力。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析。用Shapiro-Wilk檢驗衡量計數資料和計量資料的正態性，Levene’s test檢驗方差齊性，計數資料采用例數（%）描述，符合正態分布的計量資料采用描述。2組間年齡、智商比較采用t檢驗，2組間基因型和等位基因頻率比較采用x2檢驗，組別、基因活性分組因素對執行功能的影響采用無重復測驗二因素方差分析等方法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組MAOA-uVNTR等位基因頻率及分布情況 MAOA基因位于X染色體上，故男性只有等位基因數據，沒有基因型數據，男性中只存在VNTR-L和VNTR-H兩種等位基因。根據Abol等[11]的研究結果和分組方式，將3.5次和4次重復序列定義為MAOA高活性組，本研究未檢出3.5次重復序列，高活性組只包含4次重復序列。2次、3次和5次重復序列定義為MAOA低活性組，本研究僅ADHD組檢出1例2次重復序列，因數量較少不納入分析。最終ADHD組高活性21例（占58.3%），對照組高活性13例（占43.3%），ADHD組低活性15例（占41.7%），對照組低活性17例（占56.7%）納入研究，2組等位基因頻率比較（x2=0.231），差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 2組WSCT和Stroop測試結果 采用2×2兩因素無重復測量設計進行方差分析[組別：（ADHD組、正常對照組）×（基因活性分組：MAOA高活性組、MAOA低活性組]。見表2。

表2 ADHD組與正常對照組WSCT和Stroop測試結果比較（）

表2 ADHD組與正常對照組WSCT和Stroop測試結果比較（）

注：F（組別）：組別分組F值；F（基因）：基因活性分組F值

測驗指標ADHD組（n=37）正常對照組（n=30）F（組別）P（組別）F（基因）P（基因）Stroop A卡片耗時數（s）30.12±6.83.26.74±9.3154.54＜0.0014.2200.038 B卡片耗時數（s）27.82±5.90.26.76±5.02 3.09＜0.0890.2900.091 C卡片耗時數（s）62.28±15.9044.90±19.961.44＜0.0013.4600.042干擾效應（s）29.55±11.4723.69±6.2714.00＜0.0103.6700.049 WSCT概念化水平15.92±7.83.27.33±8.8121.50＜0.0015.9900.020完成分類數 1.30±0.92. 2.71±1.2617.39＜0.0010.9800.331錯誤應答數28.95±8.54.20.73±8.3411.36＜0.0025.5700.025持續錯誤數14.70±8.41.10.44±5.87 5.61＜0.0249.7500.004持續應答數14.26±5.52.10.22±4.04 4.99＜0.0330.1310.720

3 討論

Barkley[12]提出ADHD的執行功能缺損理論，認為ADHD最主要的缺陷是行為抑制。本研究結果顯示ADHD組和對照組的Stroop色詞測驗中完成卡片A和卡片C的耗時數、干擾效應的耗時數，WSCT概念化水平、完成分類數、錯誤應答數、持續錯誤數、持續應答數等差異有統計學意義；說明多動癥兒童存在一定程度反應抑制缺陷和執行功能失調，與國內外大多數研究結果一致。本研究的結果顯示按照基因活性分組因素對WSCT的概念化水平、持續錯誤數、錯誤應答數，Stroop色詞測驗中的完成卡片A和卡片C的耗時數，干擾效應的耗時數影響差異有統計學意義。這一結果說明MAOA基因活性因素與多動癥兒童的持續性操作能力、抽象概括能力、概念形成及運用能力、干擾抑制能力等執行功能有關，且低活性組部分執行功能優于高活性組。

注意障礙和執行功能失調是ADHD的核心認知功能缺陷，也是主要的遺傳內表型[13]。但關于ADHD遺傳內表型與遺傳基因的相關性研究較少，Biehl等[14]研究發現COMT基因Val158Met多態性與ADHD兒童工作記憶有關；國內張躍兵等[15]研究發現COMT基因rs4680多態性與ADHD的概念形成等執行功能有關；錢秋謹等[16-17]分別對238例和333例ADHD兒童的研究顯示COMT基因Val158Met多態性、MAOA基因多態性與ADHD男性患兒智商有關。遺傳學研究顯示MAOA基因長等位基因（3.5R、4R）的轉錄活性是短等位基因（3R、5R）的2～10倍[18]，MAOA低活性基因型能減慢DA的清除速率，從而提高腦內突觸間隙DA水平，利于ADHD認知功能的發展，MAOA低活性基因型能減慢5-HT的清除速率，從而提高腦內突觸間隙5-HT水平，有利于ADHD認知功能的發展[19]。越來越多的證據表明，5-HT系統對學習和記憶過程有重大影響，其相關受體均定位于與學習和記憶有關的腦區，包括海馬、杏仁核和皮質[20]。5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT可促進動物實驗中大鼠學習的獲得、鞏固和維持[21]。國內外關于MAOA-uVNTR與ADHD的相關性研究所得出的結論并不一致[13]。本研究未發現MAOA-uVNTR各等位基因分布與ADHD存在關聯，研究結果的不一致可能與樣本量小，未考慮性別和臨床表型的異質性等因素有關。

研究中我們發現MAOA基因活性與ADHD兒童部分執行功能存在一定的相關性，這有助于我們對多動癥的病理生理機制的進一步認識，但本研究尚不能確定所有執行功能均與MAOA基因活性因素有關。目前認為ADHD是一種多基因遺傳疾病，遺傳基礎在易患性上起決定作用。目前研究發現與ADHD發病可能相關的遺傳基因較多，研究較多的如多巴胺轉運體蛋白基因（dopamine transferase，DAT1）、多巴胺D4受體基因（DRD4）、多巴胺D5受體基因（DRD5）、MAOA、5-羥色胺受體2A基因（5-hydroxy-tryptamine type 2A-receptor，5-HT2A）、兒茶酚胺氧位甲基移位酶（COMT）、多巴胺β-羥化酶（DβH）基因、5-羥色胺轉運體（5-HTT）等[22]。所以某一基因對ADHD的神經內表型的影響相對有限，但如果某遺傳基因與遺傳內表型相關性越大可能說明此遺傳基因對于疾病發病起的作用越大。由于本次實驗ADHD組與對照組的例數相對較少，再加之未入組女性ADHD患兒，可能也是得出部分陰性結果的原因之一。本研究僅涉及患兒的執行功能，未涉及執行功能中的工作記憶、定勢轉移、計劃能力等方面，有待進一步研究。

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（本文編輯：吳彬）

Correlative analysis between executive function of attention-deficit hyperactivity disorder in Han nationali-ty people and the activity of monoamine oxidase A gene

WANG Weiqian, DU Songmei, YANG Chuang, CHEN Hong, ZHAO Yongzhong, LIANG Yan, LIN Haixi, ZHANG Xiaoyan, WANG Changlv, WANG Meihao, HE Jincai. Department of Psychiatry, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the relationship between polymorphism of MAOA gene activity and the executive function of attention-defcit hyperactivity disorder (ADHD). Methods: Choose 37 patients who was diagnosed as ADHD and 30 normal volunteers as controls. The executive function was evaluated using wisconsin card sorting test (WCST) and Stroop test. Taking peripheral blood and restriction fragment length polymorphism (RFLP) techniques were performed to detect MAOA 30 bp tandem repeats multiple of variable number, according to this repeats multiple, the case and control groups were divided into high and low activity group, respectively. Results: Group factor had signifcant effects on conceptual level, the number of completely classifcations, the number of wrong answers, the number of continually mistakes, the number of continually answers in WCST; Group factor also had statistical signifcant differences on the complete time between A and C card in Stroop test (P＜0.001), the time of interference effects also had statistically signifcant (P＜0.05); MAOA gene activity factor had signifcant infuence on conceptual level, the number of continually mistakes and the number of wrong answers had statistically signifcant on the difference of complete time in STROOP A card and C card (P＜0.05), the time of interference effects also had statistically signifcant (P＜0.05). There was no statistically signifcant in allele distribution of MAOA gene between the ADHD cases group and the control group (P＞0.05). Conclusion: Our study fnd no relationship between MAOA-uVNTR allele distribution and ADHD, However, there maybe have relationship between MAOA polymorphism and part of the executive function.

attention-deficit hyperactivity disorder; MAOA-uVNTR; executive function; stroop test; wisconsin-sorting test

2015-03-20

浙江省自然科學基金資助項目（LY14H090012）；溫州市科技局科技計劃項目（Y20130163）。作者簡介：王維千（1980-），男，黑龍江哈爾濱人，住院醫師。

何金彩，教授，碩士生導師，Email：hjc@wzmc.edu.cn。

R749.94

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.004