金黃色葡萄球菌雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)SaeRS對(duì)重要毒力基因的分子調(diào)控機(jī)制

許園園，丁宇，劉云靈，李丹，王良興，余方友

（1.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 寧波 315041；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

金黃色葡萄球菌雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)SaeRS對(duì)重要毒力基因的分子調(diào)控機(jī)制

許園園1，丁宇2，劉云靈3，李丹2，王良興3，余方友2

（1.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 寧波 315041；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

目的：初步研究金黃色葡萄球菌雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)SaeRS對(duì)重要毒力基因的分子調(diào)控機(jī)制。方法：PCR擴(kuò)增雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)SaeRS的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR，用限制性酶切、PCR和基因測(cè)序方法進(jìn)行鑒定。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白HisSaeR，用鎳離子螯合親和層析法純化，用Western blot法鑒定。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌SA75及SA75ΔsaeRS突變株luk-PV、hla、coa、fnbB、sak、psmβ基因轉(zhuǎn)錄水平。凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證純化蛋白HisSaeR對(duì)這些毒力基因啟動(dòng)區(qū)序列的結(jié)合能力。結(jié)果：重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR構(gòu)建成功；在0.4 mmol/L IPTG，25 ℃培養(yǎng)12 h的條件下，重組蛋白HisSaeR在大腸桿菌中以可溶形式高效表達(dá)；與SA75野生株相比，?saeRS突變株luk-PV、hla、coa、fnbB基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降，分別為野生株的19.7%、0.3%、31.6%、3.5%；psmβ基因和sak基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)變化。反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR能有效結(jié)合luk-PV、hla、coa、fnbB及其自身P1啟動(dòng)區(qū)序列。結(jié)論：金黃色葡萄球菌雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)SaeRS對(duì)luk-PV、hla、coa、fnbB基因表達(dá)具有正調(diào)控作用，而這種作用可能是通過(guò)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR與這些基因啟動(dòng)區(qū)序列直接結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。

金黃色葡萄球菌；雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)；saeRS；反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR

金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院獲得性和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一，可引起一系列的疾病，包括輕微的皮膚癤癰、創(chuàng)口感染和食物中毒、膿毒性關(guān)節(jié)炎，以及致命性的、深部的壞死性肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥及多發(fā)轉(zhuǎn)移性并發(fā)癥等[1-3]。金黃色葡萄球菌的高致病性與其產(chǎn)生的多種毒力因子密切相關(guān)，包括在生長(zhǎng)早期高表達(dá)的細(xì)胞壁及細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，如纖維蛋白結(jié)合蛋白（FnbB）等，和生長(zhǎng)晚期高表達(dá)的分泌型蛋白，如殺白細(xì)胞素（PVL）、α-溶血素（Hla）、血漿凝固酶（Coa）、葡萄球菌激酶（Sak）、β-酚溶調(diào)節(jié)蛋白（Psmβ）等，這些毒力因子參與細(xì)菌的黏附、內(nèi)化、炎癥反應(yīng)、組織損傷、免疫逃避及細(xì)胞毒性等致病過(guò)程[1，4]。

金黃色葡萄球菌存在著一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，包括sar、sigB、rot等DNA結(jié)合蛋白[5]和agr、saeRS、arlRS等雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)[6-7]（two-component signal transduction systems，TCSs），共同調(diào)節(jié)毒力基因的表達(dá)。金黃色葡萄球菌saeRS（staphylococcus aureus exoprotein expression）就是典型的TCSs。saeRS由2個(gè)共轉(zhuǎn)錄基因saeR和saeS組成，分別編碼反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR和組氨酸蛋白激酶SaeS[8]。金黃色葡萄球菌TCRS-SaeRS對(duì)多種毒力基因的表達(dá)都是必需的，被認(rèn)為是關(guān)鍵的全局調(diào)節(jié)子之一。但SaeRS是如何對(duì)毒力基因進(jìn)行調(diào)節(jié)的分子機(jī)制目前還不是很清楚。為此本研究表達(dá)純化雙組份中的反應(yīng)蛋白SaeR，檢測(cè)saeRS基因敲除后毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化，同時(shí)初步驗(yàn)證SaeR蛋白與疑似靶基因啟動(dòng)子區(qū)序列的結(jié)合能力。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 金黃色葡萄球菌臨床分離株（SA75）及其saeRS敲除株?saeRS[9]，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存（具體的構(gòu)建方法及敲除株的驗(yàn)證見(jiàn)本課題組先前發(fā)表的文章，參考文獻(xiàn)[9]。大腸埃希菌E.coli DH5α及BL21（DE3）購(gòu)于天根生化科技有限公司；表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒，購(gòu)自Novagen公司。

1.2 儀器和試劑 Realplex熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；超聲破碎儀（美國(guó)Qsonica公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；限制性內(nèi)切酶XhoI和BamHI購(gòu)自Fermentas公司；DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、基因和質(zhì)粒組抽提試劑盒、蛋白定量試劑盒、HisTag單抗購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司；溶葡萄球菌酶、IPTG購(gòu)于上海生工有限公司；RNA抽提試劑盒、Ni-NTA agarose購(gòu)于Qiagen公司；SYBR Premix Ex Taq購(gòu)于TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Bio-Rad公司；DIG Gel Shift Kit購(gòu)于Roche公司；羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)于Santa cruz公司；引物合成和DNA測(cè)序由上海桑尼有限公司完成。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR的構(gòu)建和鑒定 本實(shí)驗(yàn)所有引物均根據(jù)NCBI上公布的金黃色葡萄球菌MW2基因組（NC-003923）序列設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。以SA75菌株的基因組為模板，saeR-F和saeR-R為引物，擴(kuò)增saeR基因全長(zhǎng)片段；經(jīng)快速限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI雙酶切后連入pET28a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α，抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切、PCR及DNA測(cè)序后獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR，隨后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.coli BL21（DE3），獲得重組表達(dá)菌株BL21-pET28a-saeR。抽提重組質(zhì)粒，進(jìn)行BamH I、XhoI雙酶切鑒定，以saeR-F和saeR-R為引物進(jìn)行PCR鑒定，最后以pET28質(zhì)粒自帶的T7引物進(jìn)行重組質(zhì)粒的基因測(cè)序。三項(xiàng)均符合的重組質(zhì)粒即表明該重組質(zhì)粒即為成功構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR。

1.4 重組蛋白HisSaeR的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將重組表達(dá)菌株BL21-pET28a-saeR二次活化后，按1∶200比例接種于1 000 mL的Kan+（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)12 h。離心收集菌體，用PBS洗滌2次。用25 mL非變性結(jié)合緩沖液（20 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris、10%甘油，pH 8.0）重懸菌體，冰浴超聲破菌（功率200 W，超聲5 s，間隔10 s，共2～3 h），4 ℃ 15 000 g離心1 h。收集上清液，加入已平衡好的Ni-NTA agarose親和層析柱。待樣品流近后，加入30 mL的非變性沖洗緩沖液（30 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris、10%甘油，pH 8.0）洗去雜蛋白，最后加入非變性洗脫緩沖液（250 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris、10%甘油，pH 8.0）洗脫目的蛋白。SDS-PAGE分析重組蛋白。

1.5 重組蛋白HisSaeR的Western blot法鑒定 將誘導(dǎo)表達(dá)的總蛋白上清，行12% SDS-PAGE電泳后，以恒流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；經(jīng)5%脫脂奶粉在室溫封閉1～2 h，PBST清滌3次；加入鼠源anti-HisTag抗體（1∶1 000）稀釋液室溫孵育1～2 h，PBST清滌3次；加入羊抗鼠HRP-IgG（1∶2 000）稀釋液室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，最后ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.6 毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的Real time PCR技術(shù)檢測(cè)分別收集金黃色葡萄球菌SA75和?saeRS對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（3 h）和平臺(tái)期（9 h）的細(xì)菌，用RNA抽提試劑盒提取細(xì)菌總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，稀釋至濃度為100 ng/μL作為模板，進(jìn)行Real time PCR，對(duì)luk-PV、hla、coa、fnbB、sak、psmβ基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表1。其中fnbB基因以生長(zhǎng)早期表達(dá)量為高，故以3 h的cDNA為模板，而其余基因以平臺(tái)期表達(dá)量最高，故以9 h的cDNA為模板。以管家基因gyrB作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量（delta delta Ct，2-??Ct）法計(jì)算突變株毒力基因mRNA量相對(duì)于野生株的百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.7 凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn) 以SA75基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增P1、luk-PV、hla、coa、fnbB啟動(dòng)區(qū)序列，引物序列見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用地高辛進(jìn)行標(biāo)記。取不同濃度的磷酸化的重組蛋白HisSaeR和0.08 ng標(biāo)記的啟動(dòng)區(qū)序列25 ℃共孵育20 min，同時(shí)設(shè)立特異性競(jìng)爭(zhēng)劑（未標(biāo)記的啟動(dòng)區(qū)序列，記為cold）和非特異性競(jìng)爭(zhēng)劑（未標(biāo)記的saeR內(nèi)部序列，記為N）作對(duì)照。孵育完后經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至尼龍膜，120 ℃烤膜30 min，馬來(lái)酸洗液（0.1 mol/L Maleic acid、0.15 mol/L NaCl、0.3% Tween 20，pH 7.5）洗滌3次，用1× Blocking solution室溫封閉30 min，馬來(lái)酸洗液洗滌3次，加入75 mU/mL的Anti-dig-AP抗體稀釋液室溫孵育30 min，馬來(lái)酸洗液洗滌3次，隨后加入檢測(cè)緩沖液（0.1 mol/L Tris-Cl、0.1 mol/L NaCl，pH 9.5）平衡5 min，最后用CSPD化學(xué)發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR的鑒定

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR成功構(gòu)建 為體外表達(dá)金黃色葡萄球菌SA75反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR，以其基因組為模板，PCR擴(kuò)增出saeR全長(zhǎng)（保留終止子，不包括酶切位點(diǎn)，共687 bp）；PCR片段經(jīng)BamH1/ XhoI雙酶切后插入表達(dá)載體pET28a，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-saeR。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamH1/XhoI雙酶切及PCR擴(kuò)增saeR基因可得到理論大小的片段（見(jiàn)圖1）。最后DNA測(cè)序確認(rèn)基因序列正確，表明重組質(zhì)粒pET28a-saeR構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白HisSaeR的誘導(dǎo)表達(dá) 蛋白質(zhì)若能在上清中表達(dá)，可減少實(shí)驗(yàn)操作對(duì)其自然構(gòu)型及功能活性的破壞，而溫度對(duì)表達(dá)影響較大，故對(duì)誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。在細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600為0.6時(shí)加入0.4 mmol/L IPTG，之后分別在37 ℃誘導(dǎo)6 h，30 ℃誘導(dǎo)8 h和25 ℃誘導(dǎo)12 h的條件下誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體后經(jīng)超聲破碎處理，高速離心后取裂解上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果顯示：誘導(dǎo)后的重組表達(dá)菌株BL21-pET28a-saeR的裂解上清液均可見(jiàn)約29 kDa大小的誘導(dǎo)條帶，與預(yù)測(cè)蛋白的分子量一致，且25 ℃誘導(dǎo) 12 h條件下的HisSaeR表達(dá)水平較高，而空載菌株BL21-pET28a未見(jiàn)誘導(dǎo)條帶（見(jiàn)圖2）。

圖2 重組蛋白HisSaeR在E.coli BL21中的表達(dá)

2.3 重組蛋白HisSaeR的鑒定結(jié)果 為鑒定29 kDa大小的蛋白確實(shí)為目標(biāo)蛋白，利用重組蛋白所帶的His標(biāo)簽，以anti-HisTag抗體為一抗，采用Western blot法對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：含重組質(zhì)粒pET28a-HisSaeR的E.coli BL21的菌體裂解上清中，可檢測(cè)到信號(hào)，而含空載pET28a質(zhì)粒的E.coli BL21菌體裂解上清中未檢測(cè)到信號(hào)（見(jiàn)圖3），從而確認(rèn)該條帶即是目標(biāo)蛋白。

圖3HisSaeR重組蛋白Western blot法鑒定

2.4 重組蛋白HisSaeR的純化 重組蛋白HisSaeR經(jīng)Ni-NTA agarose親和層析柱分離純化后，SDS-PAGE分析得到相對(duì)分子質(zhì)量約為29 kDa大小的較單一的條帶（見(jiàn)圖4）。

圖4 重組蛋白HisSaeR的純化

2.5 毒力基因轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果 為探索saeRS對(duì)毒力基因的分子調(diào)控機(jī)制，我們選擇了兩類基因首先進(jìn)行Real time PCR檢測(cè)，一類為與黏附、定植及擴(kuò)散相關(guān)的基因，如coa、fnbB、sak；另一類為發(fā)揮破壞細(xì)胞膜，造成免疫損傷的分泌型的毒力基因，如luk-pv、hla、psmβ。結(jié)果顯示：與SA75野生株相比，?saeRS突變株luk-pv、hla、coa、fnbB基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降，分別為野生株的19.7%、0.3%、31.6%、3.5%；psmβ基因和sak基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)變化（見(jiàn)圖5）。

圖5 毒力基因轉(zhuǎn)錄水平分析

2.6 SaeR蛋白和啟動(dòng)區(qū)序列結(jié)合能力的凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金黃色葡萄球菌磷酸化的SaeR能夠與自身P1啟動(dòng)區(qū)結(jié)合。因此首先進(jìn)行了HisSaeR和P1啟動(dòng)子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證純化的蛋白是有活性的。結(jié)果顯示：與未加蛋白的陰性對(duì)照相比，磷酸化的HisSaeR與P1啟動(dòng)區(qū)探針?lè)跤罂梢?jiàn)遷移阻滯條帶，而且隨著蛋白濃度的增加，蛋白探針復(fù)合物相應(yīng)增加，阻滯效果越明顯，當(dāng)加入125倍的特異性競(jìng)爭(zhēng)劑后阻滯效果減弱或消失，而加入125倍非特異性競(jìng)爭(zhēng)劑后，阻滯條帶仍可見(jiàn)（見(jiàn)圖6A）。提示磷酸化的重組蛋白HisSaeR能與P1啟動(dòng)區(qū)特異結(jié)合，并且證明我們的蛋白是有活性的。隨后將luk-pv、hla、fnbB、coa這4個(gè)基因的可疑啟動(dòng)區(qū)序列擴(kuò)增后dig標(biāo)記，同樣進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，磷酸化的SaeR能和這4個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)序列結(jié)合（見(jiàn)圖6B-E）。

圖6 凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SaeR與毒力基因啟動(dòng)區(qū)序列的結(jié)合能力

3 討論

典型的TCSs具有兩個(gè)組份：一個(gè)是位于細(xì)胞膜上的組氨酸激酶（histidine kinase，HK）蛋白，能夠感受外界信號(hào)的變化，使HisKA激酶功能域的組氨酸位點(diǎn)發(fā)生自身磷酸化，并將磷酸基團(tuán)進(jìn)行傳遞；另一個(gè)是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（response regulator，RR），當(dāng)接收HK傳遞的信號(hào)后，其N端的天冬氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，使其C-末端效應(yīng)區(qū)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露不同DNA結(jié)合位點(diǎn)，之后與靶基因的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[10]。目前研究表明SaeRS雙組份就是典型的TCSs，其中SaeR蛋白具有直接和靶基因啟動(dòng)區(qū)序列結(jié)合的能力。

SaeRS雙組份調(diào)控系統(tǒng)最早是通過(guò)轉(zhuǎn)座子Tn551的插入突變導(dǎo)致表型改變而被發(fā)現(xiàn)[11]。sae操縱子由2個(gè)啟動(dòng)子（P1和P3）和4個(gè)開(kāi)放閱讀框架（saeP、saeQ、saeR和saeS）組成[12]，其中saeR和saeS分別編碼RR和HK，兩者共同組成TCSs。Giraudo等[13]發(fā)現(xiàn)將SaeRS突變后凝固酶、α-溶血素、葡萄球菌蛋白A表達(dá)明顯下降，被認(rèn)為對(duì)毒力的調(diào)節(jié)具有重要的作用。Rogasch等[14]利用雙向電泳技術(shù)分析SaeRS突變株的蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其至少可以導(dǎo)致2個(gè)細(xì)胞表面蛋白和17個(gè)胞外分泌蛋白表達(dá)下降。Voyich等[15]利用臨床菌株MW2（USA400，CA-MRSA）運(yùn)用基因芯片及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法對(duì)SaeRS的功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SaeRS影響了212個(gè)基因的表達(dá)，這些基因不僅涉及細(xì)胞毒性，還涉及離子轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝及DNA修復(fù)等。雖然目前對(duì)于金黃色葡萄球菌SaeRS對(duì)毒力基因的表達(dá)調(diào)控作用研究已經(jīng)較為深入，但SaeRS對(duì)毒力基因的分子調(diào)節(jié)機(jī)制目前還不是很明確。較多的研究[16]表明SaeRS雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)處于調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的下游位置，在調(diào)節(jié)毒力的通路中起到關(guān)鍵的作用，故推測(cè)SaeRS對(duì)部分毒力基因具有直接調(diào)控作用。

因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了表達(dá)載體pET28a-saeR，純化了SaeR蛋白；隨后用RT-PCR檢測(cè)了金黃色葡萄球菌SA75和?saeRS突變株中6個(gè)重要毒力基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SaeRS對(duì)luk-PV、hla、coa、fnbB具有正調(diào)控作用，這與上述提到的文獻(xiàn)結(jié)果相一致；然后用純化的SaeR蛋白和擴(kuò)增的毒力基因的啟動(dòng)區(qū)序列進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SaeR蛋白能有效結(jié)合這些序列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金黃色葡萄球菌雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)SaeRS對(duì)luk-PV、hla、coa、fnbB基因表達(dá)的正調(diào)控作用是通過(guò)SaeR蛋白與這些基因啟動(dòng)區(qū)序列直接結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。

總之，本研究構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a-saeR，成功純化了具有DNA結(jié)合活性的重組蛋白HisSaeR，并初步驗(yàn)證了雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)SaeRS對(duì)部分重要毒力基因的直接調(diào)控作用是通過(guò)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白SaeR與毒力基因的啟動(dòng)區(qū)DNA序列結(jié)合而實(shí)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究金黃色葡萄球菌TCS-SaeRS調(diào)節(jié)毒力基因的分子機(jī)制打下一定基礎(chǔ)。但實(shí)驗(yàn)中也存在一些問(wèn)題，比如SaeR蛋白在金葡菌中的磷酸化是依賴SaeS激活的，而本實(shí)驗(yàn)是用化學(xué)方法進(jìn)行的，從而使SaeR蛋白和啟動(dòng)區(qū)之間的結(jié)合活性不佳，這或許與SaeS在整個(gè)結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮的功能有關(guān)，因此該分子機(jī)制的完美詮釋還有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：胡苗苗）

Molecular regulatory mechanism of two-component regulatory system SaeRS on important virulencegenes in Staphylococcus aureus

XU Yuanyuan1, DING Yu2, LIU Yunling3, LI Dan2, WANG Liangxing3, YU Fangyou2. 1.Department of Respiratory Medicine, Lihuili Hospital of Ningbo Medical Center, Ningbo, 315041; 2.Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 3.Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the molecular regulatory mechanism of two-component regulatory system SaeRS on important virulence genes in Staphylococcus aureus. Methods: The 687-bp saeR gene was PCR amplifed and cloned into pET28a, resulting in the plasmid pET28a-saeR, then tested by restriction enzyme analysis, PCR and gene sequencing. The recombinant proteinHisSaeR was induced by IPTG, purifed with Ni-NTA agarose and verifed by Western blot. The expression levels of luk-PV, hla, coa, fnbB, sak, psmβ genes were detected by real-time PCR. The binding abilities between SaeR and the promoter regions of virulence genes were tested by electrophoretic mobility shift assay. Results: Restriction enzyme digestion, PCR amplifcation and gene sequencing showed that the recombinant plasmid pET28a-saeR was successfully constructed. The recombinant proteinHisSaeR was effciently expressed in soluble in E.coli BL21 (DE3) induced by 0.4 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 12 hours. Compared to wild type strain SA75, the 1evels of luk-PV, hla, coa, fnbB mRNA of SA75ΔsaeRS mutant strain decreased to 19.7%, 0.3%, 31.6% and 3.5% respectively whereas the 1evels of psmβ and sak mRNA had no difference between wild type and mutant strain. The electrophoretic mobility shift assay showed that phosphorylated purifedHisSaeR could bind to the promoter regions of luk-PV, hla, coa, fnbB and P1 promoter. Conclusion: Two-component regulatory system SaeRS directly up-regulates the luk-PV, hla, coa, fnbB genes which is realized via response regulator protein SaeR combined with their promoter regions.

Staphylococcus aureus; two-component regulatory system; saeRS; response regulator protein SaeR

R378.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.09.001

2014-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81271906H2002）。

許園園（1987-），女，浙江寧波人，住院醫(yī)師，碩士。

余方友，副主任醫(yī)師，副教授，Email：wzjxyfy@163.com。