番茄紅素對慢性低氧小鼠骨密度和RANKL/OPG的影響

朱再勝，戴爽，鄭靖宇，黃卡特，吳玲，杜曉紅，李劍敏

（1．溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.老年病科；2.病理科）

·論 著·

番茄紅素對慢性低氧小鼠骨密度和RANKL/OPG的影響

朱再勝1，戴爽2，鄭靖宇2，黃卡特2，吳玲2，杜曉紅1，李劍敏2

（1．溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.老年病科；2.病理科）

目的：探討番茄紅素對慢性低氧（CH）小鼠骨密度（BMD）和核因子-kβ受體活化因子配體（RANKL）/骨保護蛋白（OPG）的影響。方法：選用8周齡C57BL/6雄性小鼠24只，隨機分為對照組（C組，n=8）、CH組（n=8）和番茄紅素組（LCP組，n=8）。C組在正常環境下飼養，CH組和LCP組低氧暴露時間為每日8 h，每周6 d，連續8周。于實驗末取血1.5 mL，ELISA法測量血清抗酒石酸酸性磷酸5b（TRACP-5b）、骨鈣素（OC）；同時檢測骨組織丙二醛（MDA）含量，超氧化物歧化酶（SOD）活性；用骨密度儀檢測股骨BMD；HE染色光鏡觀察骨組織形態學改變；用免疫組織化學技術和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術檢測骨組織骨保護素（OPG）和核因子-κ B受體活化因子配體（RANKL）蛋白及mRNA的表達。結果：①CH組股骨干骺端骨小梁分布稀疏，變細及斷裂；骨組織SOD活性、BMD和血清OC明顯低于C組；而骨組織MDA、RANKL水平、RANKL mRNA/OPG mRNA以及血清TRACP-5b顯著高于C組（P＜0.01）。②LCP能部分改善CH小鼠骨組織形態學；LCP組骨組織MDA水平、RANKL表達、RANKL mRNA/OPG mRNA和血清TRACP-5b水平低于CH組；而骨組織SOD活性、血清OC水平和BMD高于CH組（P＜0.05或0.01）。結論：番茄紅素能降低CH小鼠骨組織氧化應激水平，下調RANKL/OPG，減少骨吸收，提高BMD。

低氧；骨保護蛋白；核因子-kβ受體活化因子配體；骨密度；氧化應激；番茄紅素；小鼠

Key words: hypoxia; osteoprotegerin; receptor activator for nuclear factor-κB ligand; bone mineral density; oxidative stress; lycopene; mice

骨質疏松癥是一種以骨量低下，骨微結構損壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性代謝性骨病。低氧性疾病（如慢性阻塞性肺疾病）常伴隨骨代謝異常和骨質疏松癥[1]。研究發現，慢性低氧（chronic hypoxia，CH）會導致機體氧化應激[2]，慢性阻塞性肺病急性加重引起的氧化應激加重，可導致骨吸收較穩定期明顯增加[3]，故CH導致的氧化應激會影響骨代謝和骨密度（bone mineral density，BMD）?？寡趸瘎┓鸭t素等能通過骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）和核因子-k β受體活化因子配體（receptor acti-vator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）保護骨骼細胞抵御氧化損傷[4]。因此，本實驗擬通過CH模型，了解番茄紅素對C57BL/6小鼠CH模型的骨組織丙二醛（malondiadehyde，MDA）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和血清骨鈣素（osteocalcin，OC）、抗酒石酸酸性磷酸5b（tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRACP-5b）和BMD以及骨組織RANKL/OPG的影響，探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 免疫組織化學試劑：OPG和RANKL兔抗小鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；RT-qPCR試劑盒（美國，Invitrogen life technologies）；OPG、RANKL及內參GAPDH引物（上?？党缮锕こ逃邢薰驹O計合成）；OC、TRACP-5b（上海西唐生物科技有限公司）；MDA、SOD、總蛋白等試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗動物與分組 SPF級健康7周齡雄性C57BL/6小鼠24只，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（浙）2010-0150。適應性飼養1周后，按數字隨機法隨機分為3組，每組8只：①對照組（C組），常壓低氧艙外飼養；②CH組，置于常壓低氧艙中飼養，艙內氧濃度維持8%～11%，CO2濃度維持1%～3%[5]，暴露時間為每日8 h，每周6 d，連續8周。③番茄紅素組（LCP組），每天于進艙前灌胃番茄紅素（15 mg/kg小鼠體質量，灌胃前先溶于色拉油），其余條件同CH組。C組、CH組每天分別給予同體積的色拉油灌胃，劑量均為0.5 mL/100 g體質量。

1.3 標本采集 在實驗8周末，斷頭處死小鼠，取血1.5 mL，取血清置-80 ℃低溫保存待用。取左側股骨下端，用中性甲醛固定24 h，取出后置20% EDTA溶液中4 ℃脫鈣，用于組織形態學觀察；取左側股骨上端，置-80 ℃保存用于RT-qPCR檢測。取雙側脛骨，置-80 ℃保存用于MDA、SOD檢測。取右側股骨，用0.9%氯化鈉溶液浸濕紗布包裹，-20 ℃低溫保存，用于BMD測定。

1.4 方法

1.4.1 OC、TRACP-5b檢測：用ELISA法測定，具體操作嚴格按照試劑盒的說明書進行。

1.4.2 MDA、SOD檢測：用0.9%氯化鈉溶液1∶10稀釋勻漿，4 ℃離心（3 000 r/min，10 min）后，取上清于-80 ℃保存備用。MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）法；SOD采用羥胺法；總蛋白測定采用考馬斯亮蘭法。檢測均采用722分光光度計，具體操作嚴格按照試劑盒的說明書進行。

1.4.3 BMD測定：取出于-20 ℃保存的右側股骨，應用骨密度儀（Hologic QDR-4500）小動物軟件（Hologic、Bedford、MA，USA）程序掃描整段股骨的BMD。

1.4.4 骨組織形態學觀察：取左側股骨石蠟包埋組織，切片厚度5 μ m，切片采用連續間隔切片，間隔5張取1張，每個標本取3張切片。1張用于作HE染色，光鏡下觀察骨組織結構。

1.4.5 免疫組織化學法檢測OPG、RANKL蛋白的表達：分別行OPG和RANKL的免疫組織化學染色。油鏡下觀察骨組織OPG、RANKL蛋白的表達，結果判定[6]：每張切片隨機取光學顯微鏡1 000倍5個視野，進行陽性細胞百分比計分與著色強度記分。陽性細胞百分比記分按每個視野內陽性細胞所占總細胞數的比例記分。≤5%、6%～25%、26%～50%、＞51%分別記分為0、l、2、3分。著色強度記分：按陽性細胞著色（顏色）無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強（棕褐）分別記分為0、l、2、3分。上述兩種記分結果相加，0～1分為陰性（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分中等陽性（++）； 6分為強陽性（+++）。

1.4.6 RT-qPCR檢測OPG、RANKL和GAPDH mRNA表達：采用Trizol一步法提取總RNA。通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的RNA的完整性，紫外吸收測定法鑒定RNA的純度，選擇完整性和純度均符合實驗要求的RNA樣品-80 ℃保存。OPG上游引物5’-CCTGGGACCAAAGTGAATGC-3’，下游引物5’-TCTGT GGTGAGGTTCGAGTGG-3’，產物197 bp；RANKL上游引物5’-CATCGGGAAGCGTACCTACAG-3’，下游引物5’-GCTC CCTCCTTTCATCAGGTTAT-3’，產物101 bp；GAPDH（內參）上游引物5’-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’，下游引物5’-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3’，產物293 bp。反轉錄合成cDNA。用real-time RT-PCR反應體系擴增，使用SYBR Green real-time RT-PCR相對定量的方法。比較各組管家基因GAPDH以及目的基因的Ct值，運用2-ΔΔCt方法，得出mRNA的相對表達量。最終結果由PCR儀配套軟件自動計算。

1.5 統計學處理方法 用SPSS 11.5統計學軟件。計量資料以表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 股骨BMD、骨組織MDA和SOD以及血清OC、TRACP-5b變化 CH組骨組織SOD活性、BMD和血清OC明顯低于C組；而MDA和血清TRACP-5b顯著高于C組，差異有統計學意義（P＜0.01）。LCP組骨組織MDA水平和血清TRACP-5b水平低于CH組；而骨組織SOD活性、血清OC水平和BMD高于CH組，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），見表1。

表1 各組股骨BMD及骨組織MDA、SOD、OC和TRACP-5b水平（n=8，）

表1 各組股骨BMD及骨組織MDA、SOD、OC和TRACP-5b水平（n=8，）

與C組比：aP＜0.01；與CH組比：bP＜0.01，cP＜0.05

2.2 骨組織HE染色 CN組小鼠股骨干骺端骨小梁飽滿、連續，骨小梁間隙分布均勻；CH組小鼠股骨干骺端骨小梁變稀疏、變細，骨小梁間隙增寬，可見骨小梁斷裂、消失；LCP組骨小梁較CH組粗，小梁間隔變小，但仍未達到C組水平，見圖1。

圖1 左股骨下端切片（HE，×200）

2.3 免疫組織化學檢測OPG、RANKL蛋白表達 OPG的表達定位于軟骨細胞、成骨細胞胞漿和胞核，3組之間差異無統計學意義（見圖2、表2）；RANKL的表達定位于軟骨細胞、骨細胞、骨髓細胞胞漿和胞核，C組大部分表達為弱陽性（+），CH組有4只表達為強陽性（+++），LCP組有3只表達為中等陽性（++），差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）（見圖3、表2）。

圖2 左股骨下端OPG蛋白的表達（免疫組織化學，×1 000）

2.4 各組骨組織OPG mRNA、RANKL mRNA表達變化

CH組骨組織RANKL mRNA表達和RANKL/OPG比值明顯高于C組，差異有統計學意義（均P＜0.01）；LCP組骨組織RANKL mRNA表達和RANKL/OPG比值明顯低于CH組，差異有統計學意義（均P＜0.01），見表3。

圖3 左股骨下端RANKL蛋白的表達（免疫組織化學，×1 000）

表2 各組骨組織OPG、RANKL蛋白表達（n=8，±s）

表3 各組骨組織OPG、RANKL mRNA表達（n=8，±s）

3 討論

番茄紅素是自然界中存在一種很強的抗氧化劑。近年來國內外的研究證實，番茄紅素不僅促進成骨細胞的活性，而且能夠抑制破骨細胞的活性，進而阻止和減緩骨質疏松癥的發生[4，7]。本實驗顯示，CH小鼠骨組織MDA高于C組，而SOD及BMD低于C組；病理學表現為股骨干骺端骨小梁變稀疏、變細，骨小梁間隙增寬，可見骨小梁斷裂、消失，與Song等[8]研究結果一致；相反，LCP組骨組織MDA明顯降低，SOD顯著升高，BMD和骨組織病理學有所改善；可歸因于CH導致骨組織氧化應激增加，進而導致BMD低，而番茄紅素能提高抗氧化防御來抵抗氧化損傷，改善BMD和骨組織病理學。

骨代謝表明CH不僅抑制骨形成作用和成骨細胞的活性，而且可以增強骨再吸收作用和破骨細胞的活性，主要表現為血清中OC水平低，而TRACP-5b水平高。本實驗顯現的，CH對于骨形成的抑制與先前的體內外研究[8-9]結果類似。然而，CH對體內外骨吸收的影響是不同的。體外研究表明CH能促進破骨細胞形成和骨吸收[10]；Song等[8]在體內研究發現CH能抑制去卵巢大鼠的骨吸收。而本實驗顯示，CH能促進骨吸收，可能與低氧的方式和持續時間不同以及研究對象不同有關。相反，番茄紅素能保護骨骼抵御CH導致破骨細胞活性的增加，改善受抑制的骨形成作用。

RANKL/OPG的變化可以影響體內破骨功能的程度進而改變骨代謝的平衡[11]。研究發現，抗氧化劑可以通過調節RANKL/OPG改善骨代謝[12]。本實驗顯示，C組、CH組和LCP組3組間OPG mRNA和蛋白表達水平差異無統計學意義。CH組的RANKL mRNA和蛋白表達水平，RANKL/OPG比值高于C組，這與祝金香等[13]的體內研究結果一致。然而，與體外實驗結果不同，低氧抑制小鼠成骨細胞表達OPG，刺激RANKL表達，從而誘導成骨細胞介導的破骨細胞的分化成熟[10，14]，增加骨吸收。低氧對體內外骨細胞OPG、RANKL表達影響不同的原因可能是，低氧會引起體內IL-6和TNF-α等促炎細胞因子升高[15]，而IL-6和TNF-α等促炎細胞因子會干擾OPG/RANK/RANKL[16]，其機制有待研究。本實驗還顯示，與CH組比較，LCP組RANKL表達水平低，RANKL/OPG比值低，骨組織病理學和BMD有所改善，表明抗氧化劑番茄紅素能減少CH引起的骨組織氧化應激，調節RANKL/OPG比值，減少骨吸收，從而改善了BMD。

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（本文編輯：吳健敏）

Effects of lycopene on bone mineral density and RANKL/OPG in chronic hypoxia modal mice

ZHU Zaisheng1, DAI Shuang2, ZHENG Jingyu2, HUANG Kate2, WU Ling2, DU Xiaohong1, LI Jianmin2.
1.Department of Gerontology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the effects of lycopene on bone mineral density (BMD) and RANKL/ OPG in chronic hypoxia (CH) modal mice. Methods: Twenty-four C57BL/6 male mice aged 8 weeks were randomly divided into three groups: Control group (C group, n=8) and CH group (CH group, n=8) and lycopene group (LCP group, n=8). Mice in CH and LCP were exposed in hypoxic environment, 8 h/day, 6 d/week while the C group lived in normal environment. At the end of 8 weeks, the serum levels of OC and TRACP-5b were measured by ELISA. The content of malondiadehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) in shinbone were analyzed using hydroxylamine assay and TBA colorimetry. The BMD of right femurs were detected by Hologic QDR-4500 bone densitometer. Histomorphology of bone tissue was observed with H.E stainin under light microscopy. The expressions of OPG and RANKL in bone tissue were detected with immunohistochemical technique and RT-qPCR respectively. Results: Firstly, Histologically, the volume of bones trabecular were decreased and the bones trabecular distribution were sparse, thinner and fracture in bone marrow in CH group. In comparison with the C group mice, BMD and serum OC level and the activities of SOD in bone (P＜0.01) were decreased signifcantly in CH group mice, while the serum TRACP-5b level, MDA level in bone, the expression of RANKL protein and RANKL mRNA in bone and RANKL mRNA/OPG mRNA (P＜0.01) were increased signifcantly. Secondly, LCP could partially improve the histomorphometric parameters in mice with CH. The serum TRACP-5b level, MDA level in bone, the expression of RANKL protein and mRNA in bone and RANKL mRNA/OPG mRNA in LCP group mice were lower signifcantly than the levels in HC group mice, while BMD and serum OC level and the activities of SOD in bone were higher (P＜0.01 or P＜0.05). Conclusion: Lycopene can reduce oxidative stress, regulate RANKL mRNA/OPG mRNA, decrease bone resorption and improve BMD in CH mice.

R361.2

ADOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.007

2014-10-29

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20120038）

朱再勝（1979-），男，浙江樂清人，主治醫師，碩士。

李劍敏，教授，Email：wzyxyljmin@163.com。