簡易細胞塊和細胞芯片的制作方法及應用價值

曾宇婷，吳共發，林俊汕，鄭娜芬，韓靜靜，黃綺亭，區瑞章，李海剛,增城市人民醫院/中山大學孫逸仙紀念醫院增城院區病理科，廣東 廣州 5300；中山大學附屬孫逸仙紀念醫院病理科，廣東 廣州 500

細胞塊的制作方法已經有不少報道，包括利用凝血酶［1］、瓊脂糖［2］或雞蛋清［3，4］進行包埋，或離心沉淀法［2，5］，但前兩者需要特殊物質進行包埋，不利于就地取材原則，而離心沉淀法在標本有黏液等情況時細胞會不成團導致制作失敗。細胞芯片是生物芯片中的一種，具有類似組織芯片的功能，有針對科研實驗的細胞芯片制作方法[6-7]，但不適用于臨床細胞標本；有利用組織芯片原理制作細胞芯片的報道［8-9］，但這些方法同樣存在某些不足，如需要專門設備，技術要求高；有研究者發明了細胞芯片制備儀并申請了專利［10］，但該制備儀尚需技術完善、有專利保護，尚未得到推廣應用。本研究采用簡易方法制作細胞塊和細胞芯片，收到了滿意的效果，本文就制作過程中的主要技術環節和應用體會介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2013年12月～2014年6月增城市人民醫院和中山大學孫逸仙紀念醫院臨床各科室送檢的細胞學標本，其中胸腔積液38例，腹腔積液26例，EP管、離心管、磷酸鹽緩沖液（PBS）、各種即用型免疫組化抗體、即用型二步法免疫組化廣譜檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司；細胞原位凋亡檢測試劑盒（TUNEL assay）購自瑞士Roche Diagnostics；其他耗材和儀器均為病理科日常工作所需。

1.2 細胞塊制作

細胞學標本直接移入50 ml離心管，2000 r/min離心10 min，去掉液體，加入6～10 ml醋酸消化液（消除粘液和紅細胞），振動器震蕩10 min，2000 r/min離心10 min，去掉液體，如果細胞團塊過大，可分裝至其他EP管，調整細胞沉淀團塊直徑約3 mm，加入95%乙醇，2000 r/min離心10 min，去掉上清，輕輕加入4%中性緩沖甲醛，2000 r/min離心10 min，用病理切片刀將EP管底部切開，小鑷子輕輕將細胞塊頂出，包在擦鏡紙并染伊紅，放入包埋盒中，進行常規沖洗、脫水、透明、浸蠟。

1.3 細胞芯片制作

將浸蠟后待包埋的各細胞塊和不銹鋼包埋模一同放入熔融的石蠟缸中，小心按照預先編排好的位置將細胞塊排列在不銹鋼包埋模，輕輕將包埋盒蓋在不銹鋼包埋模上（圖1），用小鑷子鉗住包埋模邊緣，保持不銹鋼包埋模與地平線平行，將其平穩地取出蠟缸，放置于與地平線平行的臺面，待其凝固后即制出細胞芯片。注意操作全過程要小心謹慎，動作平穩，以免碰亂細胞塊排列順序。

圖1 細胞芯片制作示意圖

1.4 常規HE染色、免疫細胞化學和TUNEL檢測

細胞塊及細胞芯片均行HE染色，方法與組織常規HE染色相同。蠟塊3μm厚切片行免疫細胞化學檢測，方法與組織學免疫組化相同，操作按照試劑盒說明書進行。TUNEL檢測操作步驟參照說明書進行，方法與石蠟組織的TUNEL檢測過程相同。

2 結果

2.1 HE染色效果

HE染色顯示細胞塊及細胞芯片中的各種細胞著色清晰，細胞質和細胞核顯示良好，背景干凈，鏡下易于觀察（圖2A）。

2.2 免疫細胞花學染色和TUNEL檢測效果

免疫細胞化學染色顯示細胞塊及細胞芯片中的各種抗體在細胞染色表達位置正常，染色效良好（圖2B～C）。TUNEL檢測結果顯示細胞質染成淡棕黃色，發生凋亡的細胞核呈棕褐色，未發生凋亡的細胞核經過蘇木素染色后呈藍色（圖2D）。

圖2 細胞塊及細胞芯片應用價值

3 討論

細胞病理檢查已廣泛用于幫助臨床診斷腫瘤性病變。目前漿膜腔積液常規使用離心涂片法制片，制出的片質量欠佳，且不能進行免疫細胞化學檢查，影響了細胞學檢查的進一步發展。細胞塊的出現很好的解決了免疫細胞化學檢查的問題。細胞塊的制作方法包括利用某種特殊物質對細胞進行包埋，如凝血酶［1］、瓊脂糖［2］雞蛋清［3，4］，或者離心沉淀法［2，3］，利用特殊物質進行包埋雖然方法可行，但不利于就地取材原則，而離心沉淀法在標本有黏液等情況時細胞會不成團導致制作失敗。本研究在實踐中發現離心沉淀法在標本具有黏液、壞死物、較多紅細胞等時才會導致細胞無法成團，為此在此法基礎上加入醇酸消化液步驟，經過醋酸消化后的標本均能離心成團制成細胞塊，而醋酸消化液是宮頸TCT制片等必須的試劑，取用方便，無需特殊購買。

細胞塊存在某些不足之處，例如一次只能檢測一個標本，當許多標本需要檢測時，則需要逐個檢測，浪費人力物力和時間。并且當標本量多時，對多張切片進行實驗易造成人為誤差的出現，影響結果的客觀性及準確性。而細胞芯片的出現彌補了細胞塊這些缺陷。本研究從細胞塊具有體積小的特點，摸索出一種簡便的手工制備細胞芯片方法。該方法所需耗材、試劑、儀器均為日常病理科所具備，將細胞學標本按照上述方法制成細胞塊后，將浸蠟的細胞塊按照預先設計好的位置排列在包埋模上，待石蠟凝固后即可制作出石蠟細胞芯片，整個流程具有非常好的可靠性和穩定性、操作簡單方便、不需要特殊儀器、價格低廉。制作出來的細胞芯片點陣完整，排列均一，熟練操作后可以制備出多至60個點陣的芯片，經過驗證，證實各細胞結構保存良好、染色細胞顏色鮮艷，染色效果良好，免疫組化染色及TUNEL染色的陽性表達效果好，背景清晰，抗原保存良好，具有與石蠟組織一樣能永久保存的特點。

此法有幾個需要注意的環節。首先標本要加入醋酸消化液，特別是對血性、渾濁或帶黏液的標本要充分消化，這樣細胞才能成團，消化干凈的判斷方法是細胞塊肉眼觀察質地緊實，與EP管交界邊緣銳利；另外細胞塊大小以直徑3 mm為宜，太小則可咨診斷的細胞信息少，過大則在制作細胞芯片是比較占空間；初學者在制作細胞芯片時一次以10～20個點陣的芯片量為宜，否則點陣過多在操作不熟練情況下可能導致細胞芯片編號混亂而功虧一簣，熟練后方可一次制備更多點陣的芯片。本法不足之處是在將細胞塊排列在包埋模時假如操作欠熟練可能有失誤發生，但我們認為在熟練后可以避免此情況發生的。總之，該簡易手工制備細胞塊和細胞芯片方法是省時、價廉、簡便的檢測方法，可以得到質量穩定可靠，便于長期保存的細胞塊和細胞芯片，能滿足臨床和科研需要，特別適用于一般病理科、基層單位或條件簡陋的實驗室，值得推廣應用。

［1］柳瑋華,余小蒙,周小鴿.凝血酶細胞塊簡捷制備法［J］臨床與實驗病理學雜志,2007,23(6):721-722.

［2］張婉儀,羅麗花,劉惠娟,等.胸腹水細胞塊制作技術及應用［J］.臨床醫學工程,2014,21(1):44-5.

［2］鄭 暉,顏亞暉.介紹一種簡單適用的胸腹水脫落細胞石蠟包埋法［J］.中國組織化學與細胞化學雜志,2003,12(4):445-6.

［4］彭先高,羅孟疌.漿膜腔積液脫落細胞學檢查方法的改進［J］.臨床與實驗病理學雜志,26(4):504-5.

［5］吳才良,龍瓊先,劉欣雅,等.免疫組化染色在體液細胞塊中的作用［J］.成都醫學院學報,2013,8(3):316-7.

［6］ Ziauddin J,Sabatini DM.Microarrays of cells expressing defined cDNAs［J］.Nature,2001,411(6833):107-110.

［7］ Koh WG,Itle LJ,Pishko MV.Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays［J］.Anal Chem,2003,75(21):5783-9

［8］羅 毅,張露凝,李 軍.一種優化的瓊脂糖包埋細胞微陣列的制備方法［J］.基礎醫學與臨床,2004,24(6):76-8

［9］翟德忠,柴玲霞,馮萬文,等.應用組織芯片技術構建細胞免疫芯片［J］.中國現代醫學雜志,2009,19(2):213-4

［10］李文生,郭黨學,王岐山,等.細胞芯片制備儀的研究及應用［J］.西北大學學報（自然科學版）,2009,39(6):1006-100