染砷大鼠腦砷代謝研究

通信作者：鄭玉建，男，教授，博士生導師，研究方向：環境衛生學,E-mail：zhyujian6@sina.cn。

吳軍，男，副教授，研究方向：環境衛生學,E-mail：wuj1997@sohu.com。

·基礎醫學研究·

染砷大鼠腦砷代謝研究

葛龍1， 劉嘉鳴1， 夏榮香2， 魏潔群3， 吳軍1， 鄭玉建1

(1新疆醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學教研室， 烏魯木齊830011；2新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心地方病科，

烏魯木齊830000；3新疆醫科大學第二附屬醫院行政辦公室， 烏魯木齊830063)

摘要:目的研究染砷大鼠腦中砷形態代謝產物、代謝酶含量水平及其相關性，初步探討砷代謝與砷毒性機制關聯性。方法雄性清潔級Wistar大鼠20只，分成對照組及砷酸鈉低、中、高劑量組4組。各組大鼠砷酸鈉經口染毒3個月后處死并摘取腦組織。采用高效液相色譜-氫化物發生原子熒光光譜法(HPLC-HGAFS)測定并比較砷酸鈉各劑量染毒組大鼠腦組織中砷形態代謝產物[iAs(Ⅲ)、iAs(Ⅴ)、總砷(Total As)含量以及一甲基化率(PMI)、二甲基化率(SMI)]及代謝酶GSSG含量、甲基轉移酶活力、GST活力、GSH含量；通過試劑盒法分析各組大鼠腦中甲基轉移酶的活力,并探討大鼠腦中砷形態代謝產物與代謝酶的相關性。結果染毒組大鼠隨染毒劑量和時間的增加，出現生長發育遲緩及狂躁、相互撕咬等現象；砷染毒劑量升高會促進腦中iAs(Ⅲ)和總砷含量增加；同時砷染毒組腦組織中GSSG含量有所升高而GSH含量有所下降；隨染毒劑量升高，GST活力也隨之呈現升高趨勢；與對照組比較，砷酸鈉染毒各劑量組大鼠腦中PMI值均較低， SMI值有所升高(P<0.05)。砷酸鈉染毒組甲基轉移酶活力與iAs(Ⅲ)%含量呈負相關(r=-0.714，P<0.05)，與PMI和SMI均呈正相關(rPMI=0.714，rSMI=0.805，P<0.05)；砷酸鈉染毒組GSH含量與iAs(Ⅲ)%含量呈正相關(r=0.855，P<0.05)，與PMI和SMI均呈負相關(rPMI=-0.855，rSMI=-0.858，P<0.05)。結論低劑量砷酸鈉染毒會打破腦組織中GSSG與GSH的動態平衡，造成腦組織的氧化損傷，砷酸鈉染毒后其代謝產物在腦組織中可能具有一定的蓄積能力。

關鍵詞:砷代謝； 砷形態； 代謝酶； 相關性

基金項目：教育部高等學校博士點基金(20126517110002, 20126517120003)； 國家自然科學基金(81260410)； 新疆醫科大學博士科研啟動基金(2012-17)

作者簡介：葛龍 (1988-)，男，在讀碩士，研究方向：環境與健康。

中圖分類號：R599.9

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.008

[收稿日期：2014-06-13]

Study on cerebral metabolism in rats with arsenic

GE Long1, LIU Jiaming1, XIA Rongxiang2, WEI Jiequn3, WU Jun1, ZHENG Yujian1

(1DepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth，

XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China;2DepartmentofEndemic,Centersfor

DiseaseControlandPreventionofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830000，China;

3DepartmentofAdministrativeofFice,TheSecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedical

University,Urumqi830063，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the arsenic metabolites, metabolic enzyme levels in arsenic-poisoned rat brain for a preliminary study on the relationship between arsenic and arsenic toxicity mechanism. Methods20 male Wistar rats in clean grade were divided into 4 groups: control group, arsenate group in low dose, arsenate group in middle dose and arsenate group in high dose. The rats by oral administration were killed after 3 months and the brain tissues were removed. High performance liquid chromatography hydride generation atomic fluorescence spectrometry (HPLC-HGAFS) was applied to determine and compare the diencephalon arsenic metabolites [iAs(Ⅲ), iAs(Ⅴ), total arsenic (Total As) content and methylation rates (PMI), methylation rate (SMI)] and metabolic enzyme (GSSG content, methyl transferase activity, GST activity, GSH content) level in each group. Reagent kit method was taken to analyze the enzyme activity of methyl transfer and their relationship. ResultsWith the dose and time of arsenic exposure, the rats had growth retardation and manic bites; Arsenic exposure increased iAs(Ⅲ) and total arsenic content in the brain; PMI in arsenate groups was lower than that in the control group, and SMI in the control group increased (P<0.05). The activity of methyl transferase in sodium arsenate exposed group and the content of iAs (Ⅲ) % showed a negative correlation (r=0.714, P<0.05), and there was a positive correlation with PMI and SMI (rPMI=0.714, rSMI=0.850, P<0.05); The content of GSH in sodium arsenate exposed group was positively related with iAs (Ⅲ) % content (r=0.855, P<0.05), and negatively correlated with PMI and SMI (rPMI=0.855, rSMI=0.858, P<0.05). ConclusionSodium arsenate in low doses exposure could break the dynamic balance between GSH and GSSG in brain tissue and cause oxidative damage of brain tissue. Sodium arsenate exposure and its metabolites may have a certain capability of accumulation in the brain tissue.

Key words： arsenic metabolism； arsenic； metabolic enzyme； correlation

我國是飲水型砷暴露較為嚴重的國家，在高砷暴露的飲用水中主要為無機砷，而其中五價砷(iAs5+)代謝及毒性的研究相對較少。當砷在體內蓄積到一定程度時，可引起皮膚癌、中樞神經功紊亂、周圍神經系統功能改變、糖尿病等疾病及機體功能障礙[1]。楊光等[2]的研究結果顯示大鼠腦組織可能會對通過血-腦屏障的砷化物進行進一步的甲基化。到目前為止，腦砷代謝機制還不清楚，其對砷毒性機制的影響及兩者關系也尚不明確。因此本實驗研究染砷大鼠腦組織中砷形態代謝物及代謝酶水平差異，并分析其相關性，為進一步研究腦砷毒性機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組選擇清潔級雄性Wistar大鼠20只 [由新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證編號：SCXK(新)2003-0001，動物使用許可證編號：SYXK(新)2003-0001],體質量150～190 g。在濕度40%～60%、室溫18℃～22℃的環境下適應性喂養1 w后，按體質量隨機分為4組，即對照組及砷酸鈉染毒低、中、高劑量組，每組5只。

1.2主要儀器和試劑儀器：Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm,美國Hamilton 公司)，Sa-10砷形態預處理前裝置和AFS-830A 氫化物發生-雙道原子熒光光譜儀 (北京吉天儀器設備有限公司)，酶標儀型號為MC318(上海三科儀器有限公司) ，其余儀器為常規設備。試劑：去離子水(18 MΩ) 、砷酸鈉、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)等標準物質(德國Laboratories of Dr.Ehrenstorfer)、砷酸鈉(Na-2HAsO-4)分析純(湖南衡陽鳳凰化學工業廠)，大鼠甲基轉移酶活性/含量測定分析試劑盒(美國Epigentek公司)，凱基核蛋白和胞漿蛋白提取[谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量]試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，其余試劑均為分析純的常規試劑。

1.3受試物與染毒方式以Na-2HAsO-4[iAs (Ⅴ)]為受試物，對照組用去離子水替代，采用喂飼法飲水經口染毒。砷酸鈉高劑量為20 mg/kg，中劑量為6.7 mg/kg，低劑量為2.2 mg/kg。按此3個劑量配制并讓受試大鼠自由進食飲水。染毒期間，通過參考大鼠每周平均體質量及日均飲水量并結合各組染毒劑量配制染毒水溶液，以確保飲水中的砷濃度不變。經此染毒3個月后處死大鼠并取大腦組織，用4℃生理鹽水沖洗并用濾紙吸干水分并稱其濕重。-80℃液氮中冷藏保存。

1.4待測樣品的預處理量取1.0 mL不同價態不同劑量砷酸鈉染毒組勻漿后的腦組織樣品，置于不銹鋼萃取池中。萃取條件：溶劑為1.0 mL甲醇，時間2 min×5，溫度100℃，壓力1 500 Psi；在40℃離心濃縮儀上將萃取液離心濃縮，濃縮至約1.0 mL后，用超純水定容至1.0 mL，即為待測樣液。得到的待測樣液按HGAFS法分析條件經HPLC分離后定量分析。

1.5砷形態參數及相關酶水平分析方法待測樣液按砷形態分析方法以標樣、對照及低、中、高劑量組的順序依次進樣，通過HPLC-HGAFS法測定標準曲線，進而分離和測定腦中砷形態水平。腦組織砷形態分析洗脫液采用15 mmol/L的(NH-4)-2HPO-4溶液，流速為(pH=6.0)1.0 mL/min。HPLC-HGAFS儀器參數包括：載氣400 mL/min，載流7%鹽酸，負高壓285 V，燈電流為80、36 mA，屏蔽氣600 mL/min，還原劑0.35%NaOH和1.5%KBH-4溶液。按照相關試劑盒測定核蛋白(nucleoprotein)、胞漿蛋白(Cytoplasm protein)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量及甲基轉移酶(arsenic+3 oxidation statemethytransferase,As3MT)活力，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。其中，GSH含量需經蛋白校正。并分析砷形態水平[一甲基化率(PMI)=(MMA+DMA)/TAs，二甲基化率(SMI)=DMA/(MMA+DMA)]。

1.6統計學處理采用SPSS16.0軟件進行統計學分析,計量資料結果以均數±標準差(±s)表示，相關性分析采用Spearman法。經檢驗數據為非正態分布時，采用非參數檢驗進行相互比較和相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1一般情況對照組大鼠生長發育及活動均正常，未見明顯的異常行為。砷酸鈉染毒組大鼠進食量以及飲水量都會隨著染毒時間和劑量的增加而有所減少，并伴隨體質重增長遲緩，活動減少，個別大鼠會出現皮膚潮紅、被毛脫落、狂躁、相互撕咬等現象。與對照組比較，砷酸鈉染毒組大鼠腦組織的臟體比差異無統計學意義。

2.2染砷大鼠腦中砷形態代謝產物水平染毒3個月后，各組大鼠腦組織中均未檢測到iAs(Ⅴ)；與對照組比較，砷酸鈉染毒各劑量組大鼠腦中iAs(Ⅲ)和總砷含量升高(P<0.05)；與對照組比較，砷酸鈉染毒各劑量組隨砷酸鈉染毒劑量增加， PMI呈下降趨勢，且差異具有統計學意義(P<0.05)；砷酸鈉染毒各劑量組大鼠腦組織中SMI整體上呈現下降趨勢，但與對照組比較，除中劑量組外，其余劑量組均高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.3染砷大鼠腦中砷代謝相關酶水平各組大鼠在實驗3個月后，隨砷酸鈉染毒劑量的增加，染毒組大鼠腦中GSSG含量呈現先升高后降低的趨勢；而GSH含量則呈現先降低后升高的趨勢。與對照組比較，低劑量砷酸鈉染毒組大鼠腦中GSSG含量升高(P<0.05)，而GSH含量下降(P<0.05)；GST活力隨砷酸鈉染毒劑量升高而呈現升高趨勢，且高劑量組高于對照組(P<0.05)；砷酸鈉染毒組大鼠腦中甲基轉移酶活力逐漸下降，但各劑量砷酸鈉染毒組中甲基轉移酶活力均高于對照組(P<0.05)，見表2。

2.4染砷大鼠腦中砷形態代謝產物與代謝酶相關性分析砷酸鈉染毒組甲基轉移酶活力與iAs(Ⅲ)%含量呈負相關(r=-0.714，P<0.05)，與PMI和SMI均呈正相關(rPMI=0.714，rSMI=0.805，P<0.05)；砷酸鈉染毒組GSH含量與iAs(Ⅲ)%含量呈正相關(r=0.855，P<0.05)，與PMI和SMI均呈負相關(rPMI=-0.855，rSMI=-0.858，P<0.05)；砷酸鈉染毒組GST活力與總砷含量呈正相關(r=0.530，P<0.05)，見表3。

組別iAs(Ⅲ)%/(ng/g濕重)iAs(Ⅴ)%/(ng/g濕重)TotalAs/(ng/g濕重)PMISMI對照組NDND1.16±0.891.01±0.32ND砷酸鈉低劑量染毒組0.08±0.02ND42.65±5.450.92±0.020.88±0.02砷酸鈉中劑量染毒組0.29±0.05ND111.93±6.620.71±0.05ND砷酸鈉高劑量染毒組0.28±0.03ND326.34±38.550.74±0.030.01±0.01

注：“ND”表示未檢出； 與對照組比較，*P<0.05。

組別GSSG/(ng/L)甲基轉移酶活力/(U/g)GSH含量/(mg/gprot)GST活力/(U/mgprot)對照組425.78±32.012.59±0.969.94±1.518.17±3.23砷酸鈉低劑量染毒組476.52±12.2213.82±1.123.36±0.5410.52±1.25砷酸鈉中劑量染毒組366.85±13.3510.66±1.058.72±1.3514.25±7.98砷酸鈉高劑量染毒組396.25±38.217.78±1.2413.17±1.4318.91±3.54

注： 與對照組比較，*P<0.05。

指標GSSG/(ng/L)rP甲基轉移酶活力/(U/g)rPGSH含量/(mg/gprot)rPGST活力/(U/mgprot)rPiAs(Ⅲ)%-0.783<0.05-0.714<0.050.855<0.050.454>0.05總砷-0.442>0.05-0.854<0.050.914<0.050.530<0.05PMI0.783<0.050.714<0.05-0.855<0.05-0.454>0.05SMI0.874<0.050.805<0.05-0.858<0.05-0.500>0.05

3討論

3.1砷暴露對砷代謝產物的影響諸多研究均表明，砷的攝入會影響其在體內的甲基化進程[3-4]，砷在體內的毒性會通過甲基化進程調控代謝產物的構成以及代謝酶的活力來體現，有機砷代謝產物的毒性往往要高于無機砷，所以探討砷毒性機制與研究砷甲基化代謝是密不可分的[5]。本研究結果顯示，砷酸鈉會促進腦中iAs(Ⅲ)和總砷含量增加，雖然PMI低于對照組，但DMA以及MMA的含量隨劑量的升高而有所增加，且SMI高于對照組。提示砷酸鈉會促進腦中無機砷含量的增加，且隨外暴露劑量升高有增加趨勢；與對照組比較，砷酸鈉染毒導致砷二甲基化產物的累積增多，從而也會蓄積相對更多的甲基化產物，進而表明砷酸鈉染毒對大鼠腦組織會有一定的毒性蓄積能力，并且對腦部神經產生毒性作用。

3.2砷暴露對砷代謝酶的影響在沒有外界干擾的情況下，生物體內GSH和GSSG通常處于動態平衡狀態。在砷代謝過程中，代謝產物可通過對谷胱甘肽還原酶和硫氧蛋白還原酶的強烈抑制作用，進而影響細胞維持正常的還原狀態能力[6]。有研究表明即使攝入微量的砷，也會對體內氧化還原的平衡產生不同程度的影響，使腦脂質過氧化水平升高、 GSH濃度和抗氧化酶活力降低，從而使腦組織自由基受到損害，引起神經細胞異常凋亡[2，7]。本研究結果顯示，砷酸鈉低劑量染毒組大鼠腦組織中GSSG含量高于對照組、 GSH含量低于對照組，表明低劑量砷酸鈉染毒會對GSSG有一定的促進作用以及對GSH產生抑制作用，從而打破GSH和GSSG之間的動態平衡，造成正常的還原狀態能力降低而對腦組織產生毒性蓄積作用。本研究結果還發現，各劑量砷酸鈉染毒組大鼠腦組織中甲基轉移酶的活力均高于對照組，且低劑量砷酸鈉染毒對大鼠腦中甲基轉移酶活力的促進更為明顯，提示砷酸鈉在腦組織中有具有一定的砷代謝能力，同時也說明砷酸鈉在腦組織中的代謝更為徹底和全面。

3.3腦砷代謝與砷毒性關系有研究顯示，成年大鼠的血腦屏障可以阻止iAs(Ⅴ)進入腦中，但部分的DMA會通過成年大鼠的血腦屏障[8]；也有研究認為，肝、腎等臟器砷蓄積最為嚴重，可能是由于砷經肝、腎代謝導致。雖然腦組織中砷濃度最低，但表明仍有部分可通過血腦屏障而對不同區域腦組織造成實質性無法恢復的傷害[9]。本研究結果顯示，腦組織中的砷形態代謝產物主要是DMA，且DMA含量隨砷酸鈉染毒劑量的升高而升高，表明DMA可透過血腦屏障進入腦組織。提示iAs(Ⅴ)甲基化代謝產物可進入腦組織并對其產生毒性影響，且腦組織中砷代謝相關酶含量、活力及代謝酶與代謝產物相關系數會隨砷酸鈉染毒劑量的改變而改變，提示砷酸鈉會通過血腦屏障，并且腦組織具有砷代謝能力，這與金亞平等[10]研究得出的結論一致。相關研究已表明砷酸鈉會通過血腦屏障引起大鼠腦皮質活性以及遞質濃度發生改變，可能會導致中樞神經系統紊亂，引起神經行為功能異常，從而影響聽覺、視覺、應激反應等基本能力，對腦組織記憶功能、神經行為功能損害明顯，進而使大鼠的行為習慣發生不同程度的改變，影響其大腦生長發育[11-13]。

人群流行病學調查也有類似報道，地方性砷中毒病區長期飲用含砷水的兒童智商均值較全國農村兒童智商理論分布值略低，長期記憶力和語言能力都有所下降，說明病區兒童智力發育存在障礙，智力受到了不同程度的損傷[14]。

綜上所述，本研究結果表明，低劑量砷酸鈉染毒會打破腦組織中GSSG與GSH的動態平衡，造成腦組織的氧化損傷，砷酸鈉染毒后其代謝產物在腦組織中可能具有一定的蓄積能力。至此，砷致神經毒性機制目前研究還不是很清楚，關于砷代謝與砷毒性機制的關系還需深入研究。

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(本文編輯王艷)