柿葉黃酮對 ApoE 缺失小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩定性的影響

柿葉黃酮對ApoE缺失小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩定性的影響

陳英珠白衛娜時瑋吳萌

(河北省科學院生物研究所，河北石家莊050051)

摘要〔〕目的觀察柿葉黃酮對頭臂干動脈粥樣硬化斑塊(AS)穩定性的影響。方法高脂飼料飼喂的載脂蛋白(Apo)E-/-缺失小鼠，灌胃給予柿葉總黃酮，觀察其對頭臂干AS斑塊形成和穩定性的影響。檢測血清血脂含量和斑塊內脂質沉積。結果柿葉總黃酮連續灌胃12 w，與模型組比較，柿葉黃酮組AS斑塊面積與管腔面積比從34%降低至14%；斑塊內包埋的纖維帽數量減少71%；MMP-9陽性染色明顯減少。油紅O染色面積減少53%。對血脂無顯著影響。結論柿葉總黃酮顯著降低頭臂干AS的形成，可能減少不穩定性斑塊形成和血管壁內脂質沉積。

關鍵詞〔〕柿葉黃酮；動脈粥樣硬化斑塊穩定性；斑塊內脂質沉積

中圖分類號〔〕R2〔

第一作者：陳英珠(1962-)，女，博士，副研究員，主要從事中藥藥理學研究。

研究表明柿葉黃酮抑制動脈粥樣硬化(AS)斑塊形成〔1，2〕，但AS對斑塊穩定性的影響尚不是十分清楚。本文以載脂蛋白E缺失(ApoE-/-)小鼠為材料，研究柿葉黃酮對頭臂干AS斑塊穩定性的影響。

1材料和方法

1.1材料ApoE-/-小鼠購自北京大學醫學部實驗動物中心，高脂飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供(含21%豬油和0.15%膽固醇)。MMP-9購自Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒為中杉產品。辛伐他汀由汕頭金石制藥總廠生產。柿葉黃酮有本研究室自制，純度≥25%，其他試劑均為國產分析純。

1.2實驗分組實驗分為3組：模型組、柿葉黃酮組和辛伐他汀組(對照組)。8 w的雄性ApoE-/-小鼠60只，每組20只，自由飲水，飼喂高脂飼料。治療組和辛伐他汀組分別灌胃給予30 mg·kg-1·d-1體重柿葉黃酮和辛伐他汀，模型組灌胃給予生理鹽水。

1.3病理學觀察連續灌胃12 w后，小鼠經麻醉后采血、處死，取頭臂干動脈血管，生理鹽水清洗管腔，OCT包埋，冰凍切片，連續橫切，片厚8 μm,HE染色或油紅O染色。普通OLYMPUS光學顯微鏡觀察并采集圖像。采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統對血管腔面積和動脈粥樣硬化總面積及油紅O染色面積進行相對定量分析。

1.4血脂測定連續灌胃12 w后，小鼠經麻醉后采血，分離血清。按常規方法，應用日立-7170全自動生化儀測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。

1.5彈力纖維染色采用間苯二酚-堿性品紅染色法(Hart氏改良法)。

1.6免疫組化常規方法進行。MMP-9抗體濃度1∶400。結果采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統進行灰度值測定：灰度值越大，表明陽性染色顆粒表達越少，反之，表達越多。

1.7統計學方法采用SPSS13.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2結果

2.1柿葉黃酮對AS斑塊形成的影響與模型組相比，服用柿葉黃酮后，斑塊面積與空腔面積比由0.34降至0.14(P<0.05),與辛伐他汀組相比，兩者之間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

組別管腔面積(μm2)斑塊面積(μm2)斑塊面積/管腔面積模型組39137.88±2719.5513329.95±3079.070.33±0.07柿葉黃酮組38580.37±3014.445360.79±1948.160.12±0.021)辛伐他汀組41314.54±2717.385959.47±2516.880.14±0.041)

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

2.2柿葉黃酮對AS斑塊內包埋的纖維帽數量的影響喂高脂飼料12 w。與模型組比較，柿葉黃酮組及辛伐他汀組AS斑塊內包埋的開維帽數量明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

組別油紅染色面積(μm2)包埋纖維帽數MMP-9模型組13709.08±2765.140.42±0.15137.79±14.92柿葉黃酮組6485.66±3072.071)0.10±0.061)155.34±10.671)辛伐他汀組6689.85±3095.951)0.15±0.111)156.76±12.481)

2.3柿葉黃酮對MMP-9表達的影響高脂飼料喂飼12 w時，模型組MMP-9表達量顯著高于柿葉黃酮組和辛伐他汀組(P<0.05)。見表2。

2.4柿葉黃酮對血清血脂變化的影響飼喂高脂飼料12 w，與模型組比較，柿葉黃酮組和辛伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL、HDL各指標之間均無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.5柿葉黃酮對頭臂干血管壁脂質沉積的影響油紅O染色顯示頭臂干血管壁脂質沉積情況。喂高脂飼料飼12 w，與模型組相比，柿葉黃酮組油紅O染色面積減少53%(P<0.05)。

組別TCTGLDLHDL模型組20.89±4.021.82±0.2819.21±3.410.66±0.09柿葉黃酮組20.39±6.911.86±0.5119.45±6.010.68±0.25辛伐他汀組20.16±5.011.64±0.4518.93±4180.65±0.19

3討論

近年來研究表明，喂高脂飼料飼的ApoE-/-小鼠飼喂早期頭臂干內發生急性斑塊坍塌，隨后，斑塊內形成包埋的纖維帽〔3〕。且他汀類藥物有減少高脂飼料飼喂的ApoE-/-小鼠急性斑塊坍塌的作用。本研究結果提示柿葉黃酮顯著降低頭臂干中AS斑塊形成，顯著減少急性斑塊坍塌。

斑塊穩定性與多種因素相關，過度表達的MMP-9通過降解細胞外基質,導致纖維帽變薄，形成不穩定斑塊。脂質核心的大小和硬度對斑塊的穩定性起重要作用〔4，5〕。本實驗MMP-9免疫組化統計結果顯示，柿葉黃酮顯著降低斑塊內 MMP-9的表達。雖然柿葉黃酮對血清中脂質無顯著影響，但是，它明顯降低血管壁中脂質沉積。這些可能是柿葉黃酮維持斑塊穩定性的因素。

4參考文獻

1歐陽平,貝偉劍,賴文巖,等.柿葉黃酮抑制LDL刺激的大鼠血管平滑肌細胞增殖〔J〕.中藥材，2004；27(8):600-2.

2陳英珠，白衛娜，吳萌，等.柿葉黃酮對載脂蛋白E缺失小鼠動脈粥樣硬化的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(12)：2233-4.

3Jason Johnson,Kevin Carson,Helen Williams,etal.Plaque rupture after short periods of fat feeding in the apolipoprotein E-knockout mouse:model characterization and effects of pravastatin treatment〔J〕.Circulation,2005;111(11):1422-30.

4Brown DL,Hibbs MS,Kearney M,etal.Identification of 92-kD gelatinase in human coronary atherosclerotic lesions:association of active enzyme synthesis with unstable angina 〔J〕.Circulation,1995;91(8):2125-31.

5Libby P,Maikawa M.New insights into plaque stablization by lipid lowering 〔J〕.Drugs,1998;56(Suppl 1):9-13.

〔2013-03-13修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)