ATP敏感鉀通道在丹參酮ⅡA對抗高糖誘導血管內皮功能損傷中的作用

ATP敏感鉀通道在丹參酮ⅡA對抗高糖誘導血管內皮功能損傷中的作用

胡海燕李躍艷1李春霞2李興3陳夢華3周壽紅3

(安化縣第二人民醫院心內科，湖南安化413522)

摘要〔〕目的探討ATP敏感鉀通道(KATP)在丹參酮ⅡA(TSA)對抗高糖誘導血管內皮功能損傷中的作用。方法采用離體血管環灌流方法，檢測高糖誘導大鼠血管內皮依賴性舒張功能損傷以及血管組織中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性和KATP抑制劑格列本脲(Gly)對TSA的作用。結果高糖顯著降低了大鼠血管內皮依賴性舒張反應，TSA以濃度依賴的方式抑制了高糖誘導的損傷。高糖顯著降低了血管組織中NO含量和SOD活性而增加了MDA含量，TSA逆轉了高糖的作用，而Gly部分取消了TSA的作用。結論TSA能對抗高糖誘導的血管內皮依賴性舒張功能損傷，其機制可能與TSA增加NO的釋放，抑制氧化應激有關； Gly能部分地阻斷TSA的這種保護作用。

關鍵詞〔〕ATP敏感性鉀通道；丹參酮ⅡA(TSA)；高糖；內皮細胞；內皮依賴性舒張；一氧化氮；氧化應激

中圖分類號〔〕R363.2+1〔

通訊作者：周壽紅(1976-)，男，醫學博士，副教授，碩士生導師，主要從事心血管和老年生理學研究。

1南華大學附屬第一醫院心內科

2安化縣清塘鋪鎮計劃生育技術服務站

3南華大學醫學院生理學教研室

第一作者：胡海燕(1977-)，男，碩士，主治醫師，主要從事心內科及老年疾病的防治研究。

血管內皮細胞功能紊亂與糖尿病血管并發癥以及動脈粥樣硬化等心腦血管疾病密切相關〔1～4〕。高血糖是導致血管內皮細胞功能損傷的主要原因〔5，6〕。在高糖環境下，內皮細胞氧化應激增加導致細胞因子合成及活性的改變是糖尿病血管病變發病機制之一〔7，8〕。丹參酮ⅡA(TSA)是丹參的脂溶性有效單體，具有抗缺血、缺氧、改善微循環、抑制血小板黏附聚集功能和抗血栓形成作用〔9，10〕。研究表明丹參的有效成分丹參素具有鉀通道開放的作用〔11〕。本研究觀察TSA對血管組織一氧化氮(NO)的產生以及氧化應激的影響。

1材料與方法

1.1材料TSA磺酸鈉(上海第一生化藥業有限公司)。新福林、乙酰膽堿、和阿托品ATP敏感性鉀通道抑制劑格列本脲(Gly)均為Sigma公司產品。D-葡萄糖、甘露醇、NaCl、NaHCO3等其他無機試劑均為國產分析純。NO檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)和 丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司。BCA蛋白定量試劑購自Pierce公司。BL420F生物信號采集處理系統(成都泰盟)；雄性SD大鼠(南華大學實驗動物學部提供)。

1.2離體動脈環實驗設計與分組實驗分為以下各組：①對照組：血管環用K-H液孵育6 h；②高糖損傷組：血管環用含D-葡萄糖(44 mmol/L)的K-H液孵育6 h誘導血管內皮功能的損傷〔4，15〕；③甘露醇組：血管環用含甘露醇(44 mmol/L)的K-H液孵育6 h；④TSA單獨處理組：血管環用含TSN(10-5，10-4，10-3mol/L)的K-H液孵育6 h；⑤不同濃度TSA和D-葡萄糖共同處理組：血管環用含TSA(10-5，10-4，10-3mol/L)和D-葡萄糖(44 mmol/L)的K-H液共同孵育6 h；⑥ATP敏感性鉀通道抑制劑Gly組：血管環先用Gly(10 μmol/L)預處理30 min后，再用含TSA(10-3mol/L)和D-葡萄糖(44 mmol/L)的K-H液共同孵育6 h。孵育后檢測乙酰膽堿介導的內皮依賴型舒張反應。動脈舒張反應以血管舒張張力占新福林(10-6mol/L)預收縮時引起的最大收縮張力的百分比表示。并計算各劑量反應曲線的半數抑制濃度(IC50)，以其負對數值(PD2)表示。

1.3離體動脈環的制備和血管張力的測定清潔級成年雄性SD大鼠脫頸椎處死，迅速剝取胸主動脈，放入預冷的K-H液中，清除周圍結締組織，取長約3 mm的血管環，固定于加有K-H液的恒溫(37 ℃)浴槽中，持續通入含95%O2和5%CO2混合氣體。通過BL420F生物信息采集處理系統記錄胸主動脈張力的變化。1.0 g前負荷下平衡1 h，每15 min換液1次。穩定后用100 mmol/L的氯化鉀(KCl)預刺激，以激發最大收縮，檢查血管活性。1 μmol/L的新福林預收縮后，用10 μmol/L的乙酰膽堿舒張胸主動脈以檢查血管內皮的完整性。各組大鼠胸主動脈環分別進行乙酰膽堿介導的舒張反應測定。動脈舒張反應以血管舒張最小張力占新福林(10-6mol/L)預收縮時引起的最大收縮張力的百分比表示。

1.4血管組織中NO含量的測定取長約4 cm的血管環，按上述實驗分組，每組6個血管環(分別來自6只不同的SD大鼠)，孵育結束后取出血管環，濾紙上吸干水分，秤重，用電動玻璃勻漿器制成10%組織勻漿，勻漿離心(3 000 r/min,10 min)后，取上清液，保存于-20℃冰箱。取不同組血管勻漿的上清液100 μl，按試劑盒說明分別檢測NO2-/NO3-的量，以此代表NO的含量。按BCA蛋白定量試劑盒說明進行蛋白定量。

1.5血管組織中SOD活性和MDA含量測定取不同組血管組織勻漿的上清液100 μl，按試劑盒說明檢測SOD活性和MDA含量。按BCA蛋白定量試劑盒說明進行蛋白定量。

1.6統計學處理采用SPSS14.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2結果

2.1TSA抑制高糖誘導的胸主動脈內皮依賴性舒張功能損傷與對照組相比，高糖(44 mmol/L)處理顯著降低了乙酰膽堿介導的內皮依賴性舒張反應，表現為濃度-舒張效應曲線右上移位，PD2值顯著降低(PD2值對照組和高糖組分別為6.86±0.45和5.53±0.34，P<0.05)；甘露醇組乙酰膽堿介導的內皮依賴性舒張反應和PD2值與對照組間差異無顯著性(PD2值為6.85±0.53，P>0.05)。單獨TSA(10-5，10-4和10-3mol/L)處理濃度依賴性地增加了乙酰膽堿介導的內皮依賴性舒張反應，表現為濃度-舒張效應曲線右下移位，PD2值顯著性增加(PD2值分別為7.24±0.71，7.73±0.83和7.98±0.91，均P<0.05)；TSA(10-5，10-4，10-3mol/L)濃度依賴性地抑制了高糖誘導的內皮依賴性舒張功能損傷，表現為濃度-舒張效應曲線右下移位，PD2值顯著性增加(PD2值分別為6.05±0.45，6.52±0.64和7.17±0.81，均P<0.05)。

2.2KATP抑制劑拮抗抑制高糖誘導的胸主動脈內皮依賴性舒張功能損傷與對照組相比，KATP抑制劑Gly均沒有影響胸主動脈環乙酰膽堿介導的內皮依賴性舒張反應(PD2值Gly組為6.80±0.57，P>0.05)。與高糖組相比，Gly組沒有影響胸主動脈環乙酰膽堿介導的內皮依賴性舒張反應(PD2值高糖+Gly組為5.59±0.43，P>0.05)。而高糖+TSA+Gly組與高糖+ TSA組相比，內皮依賴性舒張反應明顯降低，表現為濃度-舒張效應曲線右上移位，PD2值顯著性降低(PD2值分別為5.87±0.48和7.17±0.81，P<0.05)，這表明Gly部分取消了抑制高糖誘導的內皮依賴性舒張功能損傷的作用。見表1。

2.3ATP敏感鉀通道抑制劑拮抗抑制高糖誘導的NO水平降低與對照組相比，高糖處理顯著降低了血管組織中NO的含量(P<0.05)，TSA處理則顯著增加了血管組織中NO的含量(P<0.05)，ATP敏感鉀通道抑制劑Gly單獨處理沒有影響血管組織中NO含量(P>0.05)；與高糖組相比，高糖+ TSA組血管組織中NO含量顯著增加(P<0.05)；而高糖+ TSA+Gly組與高糖+TSA組相比，血管組織中NO含量顯著降低(P<0.05)，這表明ATP敏感鉀通道抑制劑Gly部分取消了TSA抑制高糖誘導的NO含量降低的作用。

2.4ATP敏感鉀通道抑制劑拮抗TSA抑制高糖誘導的氧化應激見表1。與對照組相比，高糖處理顯著增加了血管組織中MDA的含量，而降低了血管組織中SOD的活性(均P<0.05)，導致了氧化應激的產生；TSA處理則顯著降低血管組織中MDA含量，增加了血管組織中SOD活性(均P<0.05)。ATP敏感鉀通道抑制劑Gly單獨處理沒有影響血管組織中MDA含

組別NO(mmol/g)MDA(μmol/g)SOD(kU/g)對照組3.87±0.467.85±0.84182.34±21.461)高糖組1.27±0.151)12.69±1.361)87.66±9.131)TSA組(10-3mol/L)7.68±0.861)5.36±0.711)248.12±34.231)Gly組(10μmol/L)4.03±0.547.91±0.96179.22±19.42高糖+TSA組3.55±0.462)7.74±0.642)174.26±15.322)高糖+TSA+Gly組1.32±0.173)12.38±1.423)92.46±8.753)

與對照組比較：1)P<0.05，與高糖組比較：2)P<0.05，與高糖+TSA組比較：3)P<0.05

量和SOD活性(均P>0.05)；與高糖組相比，高糖+ TSA組血管組織中MDA的含量顯著降低而增加了血管組織中SOD的活性水平顯著增加(均P<0.05)；而高糖+ TSA +Gly組與高糖+ TSA組相比，血管組織中MDA的含量顯著增加而SOD的活性水平顯著降低(均P<0.05)，這表明ATP敏感鉀通道抑制劑Gly部分取消了TSA抑制高糖誘導的氧化應激的作用。

3討論

臨床研究顯示糖尿病病人易出現血管內皮損傷，而高糖是導致內皮功能損傷的重要原因〔12〕。本實驗發現高糖能顯著降低乙酰膽堿介導的血管內皮依賴性舒張反應，而相同濃度的甘露醇沒有損傷血管內皮依賴性舒張反應，這說明高糖環境損傷了內皮的功能與滲透壓的改變無關。TSA以濃度依賴的方式抑制了高糖所誘導的血管內皮依賴性舒張反應損傷，同時TSA也直接導致了血管內皮依賴性舒張。

內皮細胞中的NO是以L-精氨酸為底物在一氧化氮合酶的作用下產生的。NO 是一種重要的血管舒張因子，能激活血管平滑肌內的鳥苷酸環化酶，使cGMP 濃度升高，降低細胞內游離Ca2+濃度，導致血管舒張。研究顯示TSA能刺激內皮細胞分泌NO，舒張血管〔11〕。本結果表明TSA抑制高糖誘導的血管內皮依賴性舒張反應損傷，可能是通過增加NO的產生而實現的。

氧化應激是機體在遭受有害刺激后，產生了過量的活性氧簇，超出了系統對其消除能力，過剩的活性氧對細胞的DNA、蛋白質、脂質等造成巨大的損傷〔13〕。血管組織中的氧化應激可以損傷內皮功能，從而導致內皮依賴性舒張功能損傷。活性氧可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，并因此形成脂質過氧化物，其代謝產物MDA是一種有害的過氧化產物，它的含量反映氧自由基的水平及脂質過氧化的程度〔14〕。SOD是體內重要的氧自由基消除劑，消除活性氧對體內脂質、蛋白質、糖等代謝的影響及其對細胞的損傷，使機體免受損害〔15〕。研究顯示TSA能抑制糖尿病患者體內的氧化應激〔16〕。糖尿病患者體內的高糖環境是導致機體產生氧化應激的重要原因〔17〕。本實驗結果說明TSA抑制高糖誘導的血管內皮依賴性舒張功能損傷可能與TSA抑制了高糖誘導的氧化應激有關。

研究發現丹參素異丙酯有明顯的擴血管作用,其通過抑制受體介導的外鈣內流和內鈣釋放而舒張血管,血管平滑肌細胞膜上的鉀通道參與了丹參素異丙酯的擴血管作用〔11〕。KATP通道開放能保護心肌細胞對抗氧化應激，防止心肌細胞的凋亡〔18〕。本結果表明KATP開放可能是TSA對抗高糖損傷內皮舒張功能的機制之一。總之，TSA能對抗高糖誘導的血管內皮依賴性舒張功能損傷，這種保護作用可能與TSA增加NO的釋放，抑制氧化應激有關；KATP抑制劑格列本脲能部分地阻斷TSA的這種保護作用，提示KATP開放可能是TSA對抗高糖損傷內皮舒張功能的機制之一。

4參考文獻

1Tziomalos K,Athyros VG,Karagiannis A,etal.Endothelial dysfunction in metabolic syndrome：prevalence,pathogenesis and management 〔J〕.Nutr Metab Cardiovasc Dis,2010;20(2)：140-6.

2Xu J,Zou MH.Molecular insights and therapeutic targets for diabetic endothelial dysfunction 〔J〕.Circulation,2009;120(13)：1266-86.

3董宇,崔治華,宋鄂,等.糖尿病性視網膜病變血管內皮生長因子與糖基化終末產物的關系〔J〕.中國老年學雜志,2011;31(14)：2693-5.

4王瑞英,禹遠遠,王綿,等.血管內皮功能與2型糖尿病患者大血管病變的關系〔J〕.中國老年學雜志,2010;30(12)：1731.

5Wang SX,Xiong XM,Song T,etal.Protective effects of cariporide on endothelial dysfunction induced by high glucose 〔J〕.Acta Pharmacologica Sinica,2005;26(3)：329-33.

6Singh H,Brindle NP,Zammit VA.High glucose and elevated fatty acids suppress signaling by the endothelium protective ligand angiopoietin-1 〔J〕.Microvasc Res,2010;79(2)：121-7.

7Madsen-Bouterse SA,Zhong Q,Mohammad G,etal.Oxidative damage of mitochondrial DNA in diabetes and its protection by manganese superoxide dismutase 〔J〕.Free Radic Res,2010;44(3)：313-21.

8Matsumoto T,Noguchi E,Ishida K,etal.Metformin normalizes endothelial function by suppressing vasoconstrictor prostanoids in mesenteric arteries from OLETF rats,a model of type 2 diabetes 〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008;295(3)：1165-76.

9Xu S,Little PJ,Lan T,etal.Tanshinone Ⅱ-A attenuates and stabilizes atherosclerotic plaques in apolipoprotein-E knockout mice fed a high cholesterol diet 〔J〕.Arch Biochem Biophys,2011;515(1-2)：72-9.

10李艷平,保春華.丹參酮ⅡA通過阻斷MAPK抑制糖尿病大鼠血管平滑肌細胞增殖〔J〕.基礎醫學與臨床,2007;27(12)：1370-3.

11Wang SP,Zang WJ,Kong SS,etal.Vasorelaxant effect of isopropyl 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate,a novel metabolite from Salvia miltiorrhiza,on isolated rat mesenteric artery 〔J〕.Eur J Pharmacol,2008;579(1-3)：283-8.

12黃敬澤,王健.2型糖尿病腎病氧化應激與血管內皮損傷的關系〔J〕.中國老年學雜志,2009;29(18)：2377-8.

13Usuki S,Tsai YY,Morikawa K,etal.IGF-1 induction by scylated steryl β-glucosides found in a pre-germinated brown rice diet reduces oxidative stress in streptozotocin-induced diabetes 〔J〕.PLoS One,2011;6(12)：e28693.

14Thangjam GS,Kondaiah P. Regulation of oxidative-stress responsive genes by arecoline in human keratinocytes 〔J〕.J Periodontal Res,2009;44(5)：673-82.

15Park L,Min D,Kim H,etal.The combination of metallothionein and superoxide dismutase protects pancreatic β cells from oxidative damage〔J〕.Diabetes Metab Res Rev,2011;27(8)：802-8.

16羅旭敏,蔡偉,徐積兄,等.丹參酮ⅡA對2型糖尿病患者氧化應激的作用〔J〕.江西醫學院學報,2009;49(4)：90-5.

17Descorbeth M,Anand-Srivastava MB.Role of oxidative stress in high-glucose- and diabetes-induced increased expression of Gq/11α proteins and associated signaling in vascular smooth muscle cells〔J〕.Free Radic Biol Med,2010;49(9)：1395-405.

18Akao M,Ohler A,O'Rourke B,etal.Mitochondrial ATP-sensitive potassium channels inhibit apoptosis induced by oxidative stress in cardiac cells 〔J〕.Circ Res,2001;88(12):1267-75.

〔2012-11-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)