大鼠呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及意義

大鼠呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及意義

劉東雷楊洋吳愷齊宇趙松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科， 河南鄭州450052)

摘要〔〕目的探討大鼠呼吸機(jī)所致肺損傷(VILI)過程中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及意義。方法健康雄性SPF級SD大鼠 30只，7周齡，體重(220±20)g，實(shí)施麻醉和氣管切開術(shù)后分別接受不同潮氣量(VT)的通氣(通氣時(shí)間均為4 h)。隨機(jī)分為三組：對照組(A組，僅切開氣管保留自主呼吸)；常規(guī)通氣組(B組，VT=10 ml/kg)；損傷通氣組(C組，VT=40 ml/kg)。A組在氣管切開即刻，其他組在機(jī)械通氣結(jié)束后放血處死動物，Western印跡檢測肺組織Beclin1和 LC3的表達(dá)，計(jì)算肺濕/干比重(W/D比值)、MPO活性及肺泡灌洗液中總蛋白含量，光鏡下行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果在大潮氣量機(jī)械通氣4 h后，肺組織中總蛋白、W/D、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和MPO等指標(biāo)均顯著增加(P<0.05)；肺組織中Beclin1、LC3表達(dá)水平(1.21±0.11、0.91±0.11)均顯著增加。結(jié)論自噬表達(dá)的增加參與了大鼠VILI的發(fā)生。

關(guān)鍵詞〔〕呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷；自噬；肺

中圖分類號〔〕R563〔

基金項(xiàng)目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)研究項(xiàng)目(No.14A320076)；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院青年創(chuàng)新基金

通訊作者：趙松(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事胸部腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。

第一作者：劉東雷(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事自噬與胸外科疾病的相關(guān)研究。

機(jī)械通氣已經(jīng)成為搶救急危重癥病人治療的重要措施之一，但由于呼吸機(jī)使用不當(dāng)或使用時(shí)間過長引起的肺損傷，即呼吸機(jī)所致肺損傷(VILI)已成為機(jī)械通氣最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，若不及時(shí)處理可導(dǎo)致患者死亡〔1〕。本研究應(yīng)用大潮氣量(VT)機(jī)械通氣建立大鼠VILI模型，觀察VILI時(shí)自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)，探討其在VILI中過程中的意義。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與試劑健康雄性SPF級SD大鼠30只，7周齡，體重(220±20)g(河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。Bcelin1和LC3抗體購自Santa Cruz公司，β-actin抗體購自Sigma公司。總蛋白和髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均購自Sigma公司。

1.2模型復(fù)制與分組30只大鼠隨機(jī)分為三組，每組10只。A組為對照組，僅行氣管切開保留自主呼吸；B組為常規(guī)通氣組，機(jī)械通氣條件為VT 10 ml/kg，呼吸頻率(RR)40次/min，氧體積分?jǐn)?shù)(FiO2)40%；C組為損傷通氣組，機(jī)械通氣條件為VT 40 ml/kg，RR 40次/min，F(xiàn)iO240%。B組和C組的通氣時(shí)間均為4 h。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，氣管切開后插入器官導(dǎo)管行機(jī)械通氣，參數(shù)設(shè)置I∶E為1∶3，呼氣末正壓(PEEP)為零。實(shí)驗(yàn)過程中靜脈給予阿曲庫銨維持肌松，并行皮下切開股靜脈穿刺置管。A組在氣管切開即刻，其余各組在機(jī)械通氣結(jié)束時(shí)立即頸動脈放血處死動物。

1.3標(biāo)本采集及檢測大鼠處死后立即開胸小心分離兩側(cè)肺組織，取右下肺同一部位(約200 mg)立即投入液氮中保存，其余部位的肺組織稱肺濕重，然后置于37℃干燥箱中烤至恒重后稱干重，計(jì)算肺濕/干比重(W/D)。左肺用生理鹽水行肺灌洗，回收后1 500 r/min離心10 min，沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后行瑞氏染色，光鏡下行白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白的測定采用考馬斯亮藍(lán)染色，肺組織MPO活性測定采用MPO試劑盒。肺組織中Beclin1和LC3蛋白的表達(dá)采用Western印跡法，以β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)對照，圖像應(yīng)用TotalLab2.0軟件進(jìn)行灰度分析。

2結(jié)果

2.1肺W/D比值、BALF中總蛋白和白細(xì)胞計(jì)數(shù)及MPO含量的比較與A組相比，B組肺組織總蛋白、W/D、WBC和MPO等各項(xiàng)指標(biāo)的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與B組相比，C組肺組織總蛋白、W/D、WBC和MPO等各項(xiàng)指標(biāo)均顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.2肺組織Beclin1和LC3的蛋白表達(dá)變化A、B、C三組肺組織中Beclin1蛋白表達(dá)的相對灰度值分別為0.67±0.05、0.72±0.06、1.12±0.14，LC3為0.52±0.07、0.58±0.08、0.91±0.11。Beclin1和LC3表達(dá)C組均顯著高于A、B組(P<0.05)。

檢測指標(biāo)A組B組C組W/D3.14±0.233.27±0.286.13±0.371)總蛋白(g/ml)0.42±0.060.37±0.074.12±0.291)WBC(×106/L)2.45±0.272.37±0.395.89±0.751)MPO(U/g)2.98±0.783.05±0.986.75±1.181)

與A、B組相比：1)P<0.05

3討論

機(jī)械通氣是臨床上常用的治療急性肺損傷的方法，但若使用不當(dāng)也可導(dǎo)致肺損傷加重。VILI病理學(xué)特征主要是肺泡毛細(xì)血管通透性增加進(jìn)而導(dǎo)致肺間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞滲出〔2〕。肺組織W/D的變化可反映肺間質(zhì)水腫改變的程度。MPO是中性粒細(xì)胞釋放的一種過氧化物酶類，可反映肺組織中性粒細(xì)胞水平的高低；肺泡灌洗液中WBC計(jì)數(shù)可反映WBC的浸潤水平。本研究結(jié)果顯示，大潮氣量機(jī)械通氣誘導(dǎo)的肺組織損傷與肺組織炎性反應(yīng)有關(guān)。

細(xì)胞自噬是真核生物中進(jìn)化保守的對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過程，能夠通過溶酶體途徑進(jìn)行降解以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新〔3〕。已有研究表明細(xì)胞自噬與炎癥反應(yīng)之間存在一定程度的關(guān)聯(lián)〔4〕，在一定條件下自噬能夠減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)。LC3和Beclin1是自噬過程中重要的標(biāo)志性分子。Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因，在自噬溶酶體形成的過程中發(fā)揮重要作用〔5〕。LC3是哺乳動物細(xì)胞中酵母ATG8的同源物，主要定位于前自噬泡和自噬泡膜的表面，其含量的多少與自噬泡數(shù)量多少呈正比，因此LC3蛋白的多少是自噬檢測的重要指標(biāo)之一〔6〕。本結(jié)果提示，在大鼠VILI的過程中，自噬相關(guān)蛋白參與了大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的發(fā)生，與Hussain等〔7〕結(jié)果一致。

4參考文獻(xiàn)

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6Klionsky DJ,Abdalla FC,Abeliovich H,etal.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy〔J〕. Autophagy,2012;8(4):445-54.

7Hussain SN,Mofarrahi M,Sigala I,etal. Mechanical ventilation- induced diaphragm disuse in humans triggers autophagy〔J〕. Am J Respir Crit Care Med,2010;182(11):1377-86.

〔2013-03-18修回〕

(編輯袁左鳴)