電針對阿爾茨海默病大鼠海馬膠質細胞源性神經營養因子及受體的影響

電針對阿爾茨海默病大鼠海馬膠質細胞源性神經營養因子及受體的影響

劉忠錦張海燕1孫麗慧1郎尉雅1孫忠平

(齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討電針對阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)及受體GFR- a1表達的影響。 方法通過Morris水迷宮篩選56只健康Wistar大鼠，隨機分為正常組、模型組、西藥組和電針組，每組14只。正常組常規飲水和飼料，不給予任何處理。其余三組大鼠均采用聚集態Aβ25～35所致AD模型，模型組造模后不給予任何處理。電針組施以電針雙腎俞、雙太溪、雙足三里、百會、大椎等穴位治療。西藥組采用鹽酸多奈哌齊灌胃，療程4 w。治療后各組大鼠灌注固定后取海馬，用免疫組化和RT-PCR檢測大鼠海馬GDNF及受體的表達。結果與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬GDNF及其受體GFR-a1陽性細胞表達降低明顯(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組大鼠海馬GDNF、 GFR-a1陽性細胞及GDNF mRNA表達增加(P<0.05)。結論電針可能通過對AD大鼠海馬GDNF及其受體GFR-a1表達增強的影響，對神經元起到保護作用。

關鍵詞〔〕電針；阿爾茨海默病；膠質細胞源性神經營養因子

中圖分類號〔〕R245.97〔

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究資助項目(No.12521652 )

通訊作者：張海燕(1979-)，女，副教授，碩士，主要從事中西醫結合防治老年癡呆的研究。

1齊齊哈爾醫學院組胚教研室

第一作者：劉忠錦(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事中西醫結合治療老年癡呆的研究。

目前藥物治療阿爾茨海默病(AD)沒有得到顯著效果〔1，2〕，而且有很大的局限性。針刺具有疏通經絡，促進氣血運行，醒腦開竅的功效〔3〕，對大腦的功能重組和代償起著重要作用。膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)是轉化生長因子β超家族的新成員，促進神經元軸突的定向生長以及運動神經元損傷修復和神經再生等。本實驗通過觀察電針對AD大鼠海馬GDNF及受體(GFR-a1)表達的影響，探討電針改善AD學習記憶障礙的分子機制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器鹽酸多奈哌齊(江蘇豪森藥業股份有限公司，批號：H20030472)，β-淀粉樣蛋白(Aβ)25～35(Sigma公司)，大鼠抗GDNF單克隆抗體(Santa Cruz)，羊抗大鼠GFR-al多克隆抗體(R&D)，RNA抽提試劑盒TrizolReagent(Gibco)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，GDNF分子引物序列:正義5′-GACTCCAATGTGCCCGAAGA-3′，反義5′-CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC-3′，該引物產生426 bp的cDNA片段,β-actin分子引序列:正義5′-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3′，反義5′-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3′，該引物產生200 bp的cDNA片段由北京三博生物科技有限公司合成，十二烷基硫酸鈉(SDS，上海生工生物工程公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Fluka公司)。 腦立體定位儀(NARISHIGESN-2型),Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所),電針儀(上海華誼G6805-1A型)，光學顯微鏡(Olympus BX51,日本)。

1.2動物選擇及分組清潔級健康4月齡雄性Wistar大鼠60只，體重200～220 g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供(批號：2011003)，室內常溫下常規飼養，經水迷宮測試，篩選出其中56只，隨機分為正常組、模型組、西藥組和電針組，正常組常規飲水和飼料，不給予任何處理。其余三組大鼠均采用聚集態Aβ25-35所致AD模型，模型組采用造模后不給予任何處理。電針組采用造模后施以電針雙腎俞、雙太溪、雙足三里、百會、大椎等穴治療，用 0.25×0.25 mm2華佗牌無菌毫針針刺，連接G6805-1A型電針儀，電壓為2 V，頻率為30 Hz，強度以肢體局部輕微顫動為適。西藥組采用鹽酸多奈哌齊灌胃，每日0.6 mg/kg，療程4 w。

1.3模型復制10%水合氯醛3 ml/kg使大鼠麻醉后，固定在腦立體定位儀上。消毒皮膚,剪毛，在頭部做正中矢狀切口，牙科鉆孔器鉆顱有突破感，坐標為腦表面下3.5 mm,前囟1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm。在每側側腦室注射10%鏈脲霉素10 μl。用微量進樣器抽取2 μl Aβ25～35(用無菌生理鹽水將其稀釋成10 μg /pl)37℃孵育1 w，使其變為聚集狀態。創口縫合飼養，3 d后重復注射，術后大鼠每天肌注青霉素4萬單位預防感染〔4〕。

1.4各組大鼠標本的制備各組大鼠治療4 w，麻醉后固定于鼠板上，行胸腹聯合切口，切斷肋骨、膈肌，暴露出心臟，在左心室插入灌注針頭，快速灌入生理鹽水500 ml沖出組織內血液，剪開右心耳，沖洗到肝臟變白，然后注入4%多聚甲醛,當大鼠尾巴、四肢僵硬為達到效果，取腦分離海馬〔5〕。一側海馬保存至液氮罐內，一側置于4%多聚甲醛中固定24 h，取海馬標本，冠狀切片，片厚4 μm，經乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及石蠟包埋，連續切片，進行貼片，將附貼好的切片置于恒溫箱內干燥。

1.5免疫組織化學檢測GDNF和GFR-a1(SP法)石蠟切片脫蠟、水化后,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，微波修復抗原,每張切片加抗GDNF抗體或者GFR-a1抗體,4℃過夜，PBS沖洗3次，加入生物素標記的第二抗體室溫下孵育10 min，再加入鏈霉菌抗生物素一過氧化物酶溶液室溫下孵育10 min，PBS沖洗后加新鮮配制的二氨基聯苯胺(DAB)溶液5～10 min，常規脫水透明,中性樹膠封片。用Image-ProPlus分析軟件進行圖像分析,每組切片取10個視野測定積分吸光度,取平均值代表GDNF 和GFR-a1表達。

1.6RT-PCR測定測定大鼠海馬GDNF mRNA各組大鼠海馬組織PBS沖洗,勻漿后采用Trizol法獲得RNA，RT-PCR反應按試劑盒嚴格操作,PCR反應結束后，取5 μl PCR產物(內標取2.5 μl)加2 μl(6倍)樣品緩沖液混勻后進行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V電泳30 min。瓊脂糖電泳凝膠條帶經Bio-Rad Quantity one 4.4.0圖像分析系統采集電泳圖像，并進行半定量分析，結果用基因擴增條帶吸光度與內參照β-actin光密度值的比值表示。

2結果

2.1治療后免疫組織化學檢測GDNF和GFR-a1的表達與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬GDNF和GFR-a1表達明顯下降(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組表達明顯增加(P<0.05)。見表1。

組別GDNF表達陽性細胞數(個/高倍視野)GFR-a1表達陽性細胞數(個/高倍視野)正常組109.62±7.911)113.57±8.131)模型組67.54±7.3578.16±7.26西藥組91.27±6.731)97.98±7.151)電針組92.98±7.461)99.62±6.811)

與模型組比較：1)P<0.05

2.2治療后RT-PCR測定各組大鼠GDNF mRNA比較與正常組大鼠比較，模型組GDNF mRNA含量明顯降低(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組含量明顯增加(P<0.05)。見圖1。

1 正常組，2 模型組，3 電針組，4 西藥組 圖1　RT-PCR測定各組大鼠GDNF mRNA的表達

3討論

神經營養因子是一類對神經系統發揮神經營養作用的非常規營養物質〔6〕,1993年在小鼠膠質細胞系B49中發現了GDNF，GDNF通過招募GDNF受體及其酪氨酸激酶蛋白形成復合物激活下游信號轉導途徑來實現生物學效應，GFR-a1與GDNF的親和性最強。星形膠質細胞約占正常成人中樞神經系統細胞總數的40%，研究發現星形膠質細胞能釋放GDNF等大量的活性物質,對膽堿能神經受損后具有保護作用，并能預防和延緩膽堿能神經元的退行性病變〔7〕。

祖國醫學認為人到老年氣郁、氣虛,均可致血癖，而癖血入腦，精髓枯萎而癡呆。百會屬于督脈，針刺百會可以激發督脈及其他經脈的經氣，開竅醒腦，疏通腦絡淤滯，起到治療癡呆之功效。而太溪穴為補腎要穴，有調補腎氣之功，腎藏精、生髓，髓充精足則腦之神明得用。國內外許多研究發現電針對于健忘和神智的恢復有較好的治療效果〔8，9〕。

本研究表明電針刺激AD大鼠海馬GDNF及其受體正向調節，進一步對受損神經元起到保護和修復作用，所以AD大鼠癡呆癥狀得以改善。這可能是電針能有效防治老年性癡呆的作用機制。

4參考文獻

1Anitha M，Gondha C，Sutliff R，etal.GDNF rescues hyperglycemia-induced diabetic enteric neuropathy through activation of the PI3K/Akt pathway〔J〕.J Clin Inves，2006;116(2):344-56.

2Luis CA，Loewenstein DA， Acevedo A，etal.Mild cognitive impairment:directions of future research〔J〕.Neurology,2003;61(4):438-44.

3荊翔愚.針灸治療老年性癡呆進展〔J〕.河南中醫雜志，2010;30(4):415-7.

4Mansvelder HD,McGehee DS.Cellular and synaptic mechanisms of nicotine addiction〔J〕.J Neurobiol,2002;53(4):606-17.

5Wang XP,Ding HL.Alzheimer's disease: epidemiology,genetics,and beyond〔J〕. Neurosci Bull,2008;24(2):105-9.

6吳曉娟,魏明發,柴成偉,等.膠質細胞源神經營養因子在大鼠骨髓間充質干細胞神經分化中的表達〔J〕.實用兒科臨床雜志,2009;24(23): 1806-8.

7馬駿，王彥春，王述菊，等.電針對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區神經營養因子及其受體表達的影響〔J〕.針灸臨床雜志，2010;26(7):63-6.

8徐秋玲,劉濤.電針對老年癡呆癥大鼠海馬 CaMKⅡ表達的影響〔J〕.時珍國醫國藥,2013;24(1):236-8.

9楊曉航,劉智斌,牛文民,等.嗅三針對血管性癡呆大鼠學習記憶功能及海馬ChAT、 AchE活性的影響〔J〕.遼寧中醫藥大學學報,2010;12(7):40-2.

〔2013-07-11修回〕

(編輯袁左鳴)