四神丸對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清白細(xì)胞介素-1β、-4、腫瘤壞死因子-α的影響

四神丸對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清白細(xì)胞介素-1β、-4、腫瘤壞死因子-α的影響

王燕曹燕飛朱向東荀敏齊汪斌

(甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的觀察四神丸對潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β、-4腫瘤壞死因子(TNF)-α的影響。方法Wistar大鼠40只分為四組，采用2、4、6-三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇灌腸法造模，光鏡觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)并評分，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測大鼠血清IL-1β、 TNF-α、IL-4的水平。結(jié)果模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜層可見潰瘍形成，且有明顯的炎癥、充血存在，證實造模成功。模型組大鼠血清IL-1β 、TNF-α含量均高于空白組(P<0.05)，而IL-4含量低于空白組(P<0.01)；治療后，四神丸組血清IL-1β 、TNF-α水平均較模型組降低(P<0.05、P<0.01)，而IL-4含量卻顯著升高(P<0.01)。結(jié)論四神丸能夠通過下調(diào)IL-1β、TNF-α的表達(dá)，升高IL-4的表達(dá)，調(diào)節(jié)腸道異常免疫反應(yīng)、抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)潰瘍，進(jìn)而治療UC。

關(guān)鍵詞〔〕四神丸；潰瘍性結(jié)腸炎；白細(xì)胞介素-1β；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-4

中圖分類號〔〕R285.5〔

基金項目：國家自然科學(xué)

通訊作者：朱向東(1973-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治潰瘍性結(jié)腸炎的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

Influence of the Si Shen Pill on the content of interleukin-1β,interleukin-4 and TNF-α in rats with ulcerative colitis

WANG Yan，CAO Yan-Fei，ZHU Xiang-Dong，etal.

Basic Department，Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，Gansu，China

Abstract【】ObjectiveTo observe the influence of the Si Shen Pill on interleukin-1β (IL-1β) ，TNF-α and interleukin-4(IL-4)in ulcerative colitis (UC) rats.MethodsExperimental rats were divided into four groups.Model rats were made by means of the TNBS/ethanol enema.Colon organization pathological changes were observed by the light microscope.Serum IL-1β，TNF-α and IL-4 were detected by ELISA.ResultsUlceration，inflammation，congestion existed in colon mucosa of model rats，which meant the models were made successfully.IL-1β and TNF-α of model rats were higher and IL-4 was lower than those of rats in blank group(P<0.05，P<0.01).After treatment，compared with the model group，IL-1β and TNF-α were reduced and IL-4 was increased in the Si Shen Pill group(P<0.05，P<0.01).ConclusionsSi Shen Pill can reduce the IL-1β and TNF-α，increase IL-4，regulate immune abnormalities in intestines，inhibit inflammation，repair ulcers and cure UC.

【Key words】Si Shen Pill; Ulcerative colitis; IL-1β；TNF-α; IL-4

第一作者：王燕(1979-)，女，講師，碩士，主要從事中醫(yī)藥防治潰瘍性結(jié)腸炎的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是常見的炎癥性腸病，臨床以腹痛腹瀉、 黏液膿血便持續(xù)或反復(fù)發(fā)作為主要癥狀，具有癌變傾向。該病發(fā)病原因及機制尚不明確，尚缺乏滿意的治療方法，已被列為現(xiàn)代難治病之一。研究證實，四神丸對UC大鼠模型腸黏膜炎癥有較好的改善作用，但其作用機制不清，本實驗探討四神丸對實驗性UC大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-4的影響。

1材料與方法

1.1動物、試劑及儀器采用SPF級Wistar大鼠40只，體重(180±10)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗動物中心提供，SPF級動物質(zhì)量合格證號：SCXKC(甘)2004-0006；SPF級實驗設(shè)施合格證號：SYXKC(甘)2004-0006-0001561。蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、考馬斯亮藍(lán)溶液(20090825)均購自南京建成生物工程公司；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：購于北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司，由美國Sigma公司生產(chǎn)，批號為(2008-16-2)；大鼠IL-1β、TNF-α、IL-4檢測試劑盒購自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀(美國BLO-RAD公司)；CT14RD高速冷凍離心機(天美科技有限公司)；303-2型恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永鑫實驗設(shè)備儀器公司)

1.2受試藥物四神丸：由補骨脂，肉豆蔻，五味子，吳茱萸組成，藥物購于甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑室制成含藥3 g/ml浸膏劑，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。柳氮磺吡?SASP)每片0.25 g(批號：H32020026，上海三維制藥有限公司生產(chǎn))。

1.3造模方法采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制作UC大鼠模型：將大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性將TNBS/乙醇液(100 mg/kgTNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡膠輸液管輕緩注入大鼠距肛門約7～8 cm深的腸腔內(nèi)，留置數(shù)分鐘，讓動物保持平躺狀態(tài)，自然清醒。第2天即UC造模成功。

1.3.1分組與給藥、取材將實驗動物分為四組：空白組、模型組、四神丸組及SASP組，每組10只。除空白組外均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合試劑灌腸。四神丸組組給予0.2 ml浸膏劑(含生藥濃度分別為:2 g/ml)灌胃，SASP組按0.5 g/kg劑量灌胃，灌胃體積均為10 ml/kg，空白組、模型組灌服等體積生理鹽水。各組于造模后第2天開始灌胃，1次/d，連續(xù)21 d。3 w后，乙醚麻醉后于股動脈采血，室溫靜置10～20 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清，檢測指標(biāo)。脫頸處死大鼠，剖取病變最明顯處結(jié)腸5～8 cm，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗結(jié)腸，部分結(jié)腸組織以4%中性多聚甲醛固定，做病理切片，HE染色，光鏡觀察。

1.3.2結(jié)腸組織病理學(xué)及其評分參考結(jié)腸病理組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)〔1〕，由兩位富有經(jīng)驗的病理教研室老師進(jìn)行雙盲評分：①炎細(xì)胞浸潤：無0分，輕度1分，重度2分；②浸潤深度：黏膜層1分，黏膜和黏膜下層2分，結(jié)腸全層3分；③潰瘍深度：無0分，上皮1分，黏膜固有層2分，黏膜肌層3分。

1.3.3指標(biāo)檢測采用雙抗體夾心ELISA法測定IL-1β、TNF-α、IL-4，嚴(yán)格按試劑盒要求操作。在檢測波長450 nm和校正波長620 nm同時讀板，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣本含量。

2結(jié)果

2.1一般狀態(tài)模型組大鼠在造模當(dāng)天開始出現(xiàn)稀便，覓食較不主動，食量減少，肛周污濁，于1 w內(nèi)體重略有下降，毛色晦暗無光澤且被糞便沾染，持續(xù)稀便，部分大鼠有血便且肉眼可見；四神丸、SASP組隨著給藥時間的持續(xù)，癥狀明顯好轉(zhuǎn)，大部分大鼠稀便癥狀消失，基本恢復(fù)正常，糞便呈灰褐色顆粒狀，毛色逐漸轉(zhuǎn)為光亮潤澤，食量正常，活躍，體重略有增長。四神丸組比SASP組癥狀改善更為明顯。

2.2結(jié)腸組織病理學(xué)及其評分模型組大鼠結(jié)腸組織有潰

瘍，且潰瘍面較大，潰瘍深度大多至黏膜肌層；有明顯的炎細(xì)胞浸潤，且浸潤深至全層；可見血管擴(kuò)張充血、有糜爛，病變結(jié)腸黏膜可見中性粒細(xì)胞浸潤，黏膜上皮層有缺失，固有層腺體明顯減少及破壞，黏膜下層部分可見血管增生。四神丸組和 SASP組有程度不同的改善，其中四神丸組和陽性對照組比較，潰瘍基本愈合，腺體增生愈合，有明顯的愈合面存在。見圖1，表1。

2.3四神丸對UC模型大鼠血清IL-β的影響與空白組比較，模型組大鼠血清IL-β含量顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，四神丸、SASP組IL-β含量均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.4四神丸對UC模型大鼠血清TNF-α的影響與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，四神丸、SASP組TNF-α含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.5四神丸對UC模型大鼠血清IL-4的影響與空白組比較，模型組大鼠血清IL-4含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，四神丸、SASP組IL-4含量顯著升高(P<0.01)。見表1。

組別病理組織學(xué)評分IL-1β(pg/ml)TNF-α(pg/ml)IL-4(pg/ml)空白組0.75±0.5451.75±3.3546.53±11.84151.19±6.45模型組7.10±1.192)63.46±12.051)75.15±24.571)114.40±11.812)四神丸組4.17±1.404)51.31±5.023)50.93.±5.963)133.56±2.554)SASP組3.81±0.784)51.44±3.713)53.39±11.694)134.25±8.664)

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

空白組

模型組

四神丸組

SASP組

圖1各組結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(×10)

3討論

UC是發(fā)病原因不明確的炎癥性腸病，目前認(rèn)為其發(fā)病與遺傳、感染、環(huán)境影響、精神因素、免疫因素密切相關(guān)。由于本病存在病程長、反復(fù)發(fā)作、容易惡化等問題，屬于難治性消化系統(tǒng)疾病。中醫(yī)認(rèn)為本病的發(fā)生是由于飲食、勞倦、情志損傷等因素導(dǎo)致五臟失調(diào)引起。本病發(fā)生雖然與飲食傷脾有關(guān)，但由于本病病程長，“五臟所傷、窮必及腎”，所以本病發(fā)病日久易引起腎虛。因腎主二便，腎虛則大便失約而為泄瀉，臨床治療從“腎虛”論治UC是重要思路。四神丸是治療五更瀉的名方，臨床用于治療UC療效顯著，但其作用機制不明。關(guān)于UC發(fā)病機制的研究，目前比較公認(rèn)的是免疫系統(tǒng)異常與本病密切相關(guān)〔2〕。其中抗炎因子與抑炎因子的失衡，是本病的重要發(fā)病機制。IL-1β和TNF-α是炎癥反應(yīng)中非常重要的促炎因子和調(diào)節(jié)免疫因子。TNF-α還參與腸道炎癥起始與持續(xù)，是非常重要的炎癥介質(zhì)。TNF-α主要由激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其促炎機制主要是參與激活中性粒細(xì)胞和上調(diào)黏附分子、促進(jìn)肉芽腫的形成。TNF-α還能夠加強單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，刺激IL-8、IL-1等其他細(xì)胞因子合成釋放，產(chǎn)生細(xì)胞因子的瀑布效應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大〔3〕。IL-1β有多種生物學(xué)效應(yīng)，IL-1β能夠使免疫上調(diào)和促進(jìn)炎癥活性，能通過自分泌或旁分泌促進(jìn)其下游細(xì)胞因子(如TNF-α)的表達(dá)和產(chǎn)生，并和其共同作用，引起一系列腸黏膜損傷和腸道炎癥反應(yīng)。IL-1β還通過促進(jìn)白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，使趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入腸道病變部位，引發(fā)一系列腸組織破壞和腸道炎癥反應(yīng)〔4〕。IL-1β不僅作為重要促炎因子參與UC的急性期〔5〕，在UC發(fā)生的初始階段發(fā)揮重要活性，它還可反饋性的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-2,IFN-γ等表達(dá)來使炎癥反應(yīng)加速。

UC的重要發(fā)病機制之一可能是Th1/Th2亞群失衡。Th2細(xì)胞主要分泌IL-10、IL-4、IL-6等。研究認(rèn)為IL-4在UC中減少非常明顯，也有研究表明UC患者IL-4基因表達(dá)減少〔6〕。IL-4可以刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，抑制NO、其他細(xì)胞因子(如IL-1、TNF-α等)，并抑制巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和移動，從而抑制IL-1的促炎作用〔7〕，正常狀態(tài)下，人體腸黏膜能自發(fā)的分泌抗炎因子如IL-4來維持腸道免疫，IL-1β則較少分泌，二者維持動態(tài)平衡。當(dāng)受到病原刺激后，則這種平衡破壞，促炎因子升高，抗炎因子降低，則腸道炎癥發(fā)生，所以，IL-4和IL-1β在消除和抑制腸黏膜炎癥，維持腸道免疫平衡中起關(guān)鍵作用〔8，9〕。本結(jié)果顯示，四神丸治療UC的機制之一可能是抑制了UC上調(diào)的促炎因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)，升高了抗炎因子IL-4的表達(dá)，從而調(diào)整了抗炎因子與抑炎因子的平衡，糾正了腸道異常免疫反應(yīng)，使腸黏膜組織修復(fù)、炎癥和潰瘍消除。中醫(yī)復(fù)方治療炎癥性疾病是從調(diào)整臟腑功能角度恢復(fù)人體的失衡，而非直接對炎癥的抑制，中醫(yī)復(fù)方治療UC的更多機制需要進(jìn)一步研究。

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〔2013-07-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)