胸苷酸合酶基因遺傳多態性與股骨頭壞死的關聯性

胸苷酸合酶基因遺傳多態性與股骨頭壞死的關聯性

吳昌新吳國志王暉陳文生

(海南省農墾總局醫院骨科，海南海口571101)

摘要〔〕目的探討胸苷酸成酶(TS)5′非編碼區28 bp重復序列(rs34743033)及3′非編碼區遺傳多態性(rs34489327)與海南中老年人群股骨頭壞死的關聯性。方法選擇海南省股骨頭壞死患者216例作為實驗組，健康對照216例作為對照組，利用PCR方法及焦磷酸測序法檢測胸苷酸合成酶基因的遺傳多態性。結果TS 基因rs34743033多態位點3R/3R、2R/3R、2R/2R基因型實驗組中的分布頻率為79例(36.6%)、68例(31.5%)、69例(31.9%)，在對照組中為103例(47.7%)、76例(35.2%)、37例(17.1%)，組間差異顯著(χ2=13.27，P<0.05)。與其他兩種基因型相比，3R/3R在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(P<0.05),而2R/2R的頻率明顯高于對照組。TS基因rs34489327多態性位點可檢測出三種基因型，+6 bp/+6 bp、+6 bp/-6 bp、-6 bp/-6 bp在實驗組中的分布頻率為68例(31.5%)、83例(38.4%)、65例(30.1%)，在對照組中為95例(44.0%)、78例(36.1%)、43例(19.9%)，組間差異顯著(χ2=13.27，P<0.05)。與其他兩種基因型相比，+6 bp/+6 bp在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(P<0.05),而-6 bp/-6 bp的頻率明顯高于對照組。結論基因型3R/3R和-6 bp/-6 bp可能是股骨頭壞死的危險因素。

關鍵詞〔〕股骨頭壞死;胸苷酸合酶;股骨頭壞死;基因多態性

中圖分類號〔〕R68〔

第一作者：吳昌新(1969-)，男， 副主任醫師，主要從事骨科疾病的臨床與科研工作。

胸苷酸合酶(TS)基因定位于第18號染色體上18p11.32，其編碼的TS是嘧啶核苷酸合成的限速酶，控制體內胸苷酸的合成，與細胞分裂等生命活動密切相關〔1〕。5’UTR和3‘UTR的核苷酸序列及結構是影響基因表達水平的重要因素。TS基因5’端轉錄起始點上游存在28個堿基對(bp)的串聯重復序列(VNTR )結構，該序列與多種轉錄調節蛋白結合后可能刺激和增強啟動子的活性，從而影響基因表達效率〔2〕；該序列存在個體差異，在GenBank中的序列號為rs34743033。TS基因3’端1 494 bp處存在6 bp核苷酸片段的缺失或者插入(rs34489327)，該多態性可能通過影響TS mRNA的穩定性從而影響TS基因的表達〔3〕。股骨頭壞死是嚴重影響患者生命質量的骨科疾病，目前臨床上沒有特效方案。本文擬探討TS UTR多態性與股骨頭壞死的關系。

1資料與方法

1.1一般資料選取海南省2010～2013年股骨頭壞死患者216例作為實驗組，男151例，女65例，年齡40～65歲，平均58歲，病程1～15年。選擇216例健康人群作為對照組，男151例，女65例，年齡45～65歲，平均57.6歲。排除創傷性股骨頭壞死、器質性疾病、慢性病、骨質疏松等患者。

1.2基因多態性檢測①DNA提取：采用QIAamp?DNA Blood Kit提取全血DNA，采用NanoDrop2000微量紫外分光光度計(Thermo SCIENTIFIC)進行質量控制。② TS基因5’端重復序列檢測：采用PCR擴增加瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測TS基因5’端轉錄起點上游附近存在的28 bp的NVTR多態性。設計上游引物：5’- AGCAGGAAGAGGCGGAGCG-3’，下游引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，2R/2R基因型擴增片段為222 bp，3R/3R基因型大小為250 bp，2R/3R基因型出現222 bp和250 bp的兩條帶。反應體系：2倍QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10 μl，上游引物和下游引物各0.2 μl，模板DNA 2 μl，滅菌蒸餾水補足至20 μl。反應條件：98℃預變性15 min；95℃，30 s，55℃，30 s，72℃，60 s，40個循環。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。分型結果的判定方法：出現一條222 bp的單一條帶為2R/2R基因型，出現一條250 bp的單一條帶為3R/3R基因型，出現222 bp和250 bp兩條帶則為2R/3R基因型。③3’端UTR多態性(3’非編碼區的1 494 bp處6 bp核苷酸片段的缺失或插入)檢測：采用焦磷酸測序技術進行3’端UTR多態性檢測。上游引物5’- AGCAGGAAGAGGCGGAGCG-3’， 下游引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，測序引物：5’- AGCTCCCCGTGCGGCGGAC-3’，其中下游引物5’末端進行生物素標記。

1.3統計學分析利用SPSS16.0軟件行χ2檢驗。

2結果

如表1所示，TS基因5’端非編碼區3R/3R、2R/3R、2R/2R基因型分布頻率組間差異顯著(χ2=13.27，P<0.05)。與其他兩種基因型相比，3R/3R在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(P<0.05),而2R/2R的頻率明顯高于對照組。TS 基因3’端非編碼區1 494 bp處6 bp核苷酸片段的缺失或插入多態性位點可檢測出三種基因型，+6bp/+6 bp、+6 bp/-6 bp、-6 bp/-6 bp在實驗組與對照組中的分布頻率差異顯著水平(χ2=9.1，P<0.05)。與其他兩種基因型相比，+6 bp/+6 bp在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(P<0.05),而-6 bp/-6 bp的頻率明顯高于對照組。

表1股骨頭壞死患者與健康對照組非編碼區兩個遺傳多態位點的基因型比較〔n(%),n=216〕

突變位點基因型實驗組對照組χ2值P值5'UTRrs347430333R/3R79(36.6)103(47.7)13.270.0012R/3R68(31.5)76(35.2)2R/2R69(31.9)37(17.1)3'UTRrs34489327+6bp/+6bp68(31.5)95(44.0)9.10.01+6bp/-6bp83(38.4)78(36.1)-6bp/-6bp65(30.1)43(19.9) +6bp/-6bp+-6bp/-6bp148(68.5)3)121(56.0) +6bp/+6bp+6bp/-6bp151(69.9)4)173(80.1)

與3R/3R比較：1)P<0.05；與2R/2R比較：2)P<0.05；與+6 bp/+6 bp比較：3)P<0.01;與-6 bp/-6 bp比較：4)P<0.05

3討論

股骨頭壞死是嚴重影響患者生存質量的一類骨科疾病，其病因和發病機制較為復雜，是由多重遺傳學因素與環境因素相互作用，眾多病理過程參與，引起股骨頭發生部分或者完全性缺血導致骨細胞、骨髓造血細胞及脂肪細胞壞死而導致的疾病〔4〕。

組織缺血是股骨頭壞死的直接病因，在創傷性股骨頭壞死過程中，毛細血管細胞的分裂有密切關聯。TS是體內胸苷酸合成的限制酶，控制細胞分裂過程中DNA的生物合成過程，對細胞周期具有重要影響。 Shintani等〔5〕研究發現，rs34743033基因型與mRNA表達水平存在相關性。TS基因3’端1 494 bp處存在6 bp核苷酸片段的缺失或者插入，其多態性也可能通過影響TS mRNA的穩定性從而影響TS基因的表達。Mandola等〔6〕通過體外熒光標記檢測、體內測定mRNA水平的方法發現，包含+6 bp多態基因型的熒光活性和mRNA水平出現了約35%的衰減，而包含-6 bp的基因型出現了約70%的衰減；同時含有-6 bp的基因型與含有+6 bp的基因型相比出現了較高的降解率；+6 bp/+6 bp基因型的TS mRNA水平明顯高于-6 bp/-6 bp基因型。因此他們認為-6 bp等位基因在體外降低TS mRNA的穩定性，在體內降低TS的表達。

本研究結果顯示，基因型3R/3R和-6 bp/-6 bp不能是股骨頭壞死的危險因素。

4參考文獻

1Ofi T,Takahashi E.Ayuzawa D，etal．Regional assignment of the human thymidylate synthasc(TS) gene to chromosome band 18pl1.32 by nonisetopic in situ by hybridization〔J〕.Hum Genet,1990;85(5):576-80．

2Lacopetta B，Grieu F，Joseph D，etal．A polymorphism in the enhancer region of the thymidylate synthnse promoter influences the survival of colorectal cancer patients treated with 5-fluomuraeil〔J〕．Br J Cancer，2001;85(7)：827-30．

3Rich CM，Bigier J，Velicer CM，etal.Searching expressed sequence tag database：discovery and confirmation of a common polymorphism in the thymidylate synthase gene〔J〕.Cancer Epidemiol Biomark Prev，2000;9：1381-5.

4韓金寶,畢鄭鋼.老年股骨頭缺血壞死的臨床診斷及治療現狀〔J〕.中國老年學雜志,2012;32(5)：1089-91.

5Shintani Y，Ohta M，Hirabaynshi H，etal．New prognostic indicator for non-small-cell lung cancer，quantitation of thymidylate synthase by real-time reverse transcription polymemse chain reaction〔J〕．Int J Cancer，2003;104(7)：790-5．

6Mandola MV,Stochlmaeher J,Zhang W，etal．A 6 bp polymorphism in the thymidylate synthase gene causes message instability and is associat-ed with decreased intratumoral TS mRNA levels〔J〕．Pharmacogenetics，2004;14：319-27．

〔2013-07-11修回〕

(編輯徐杰)