瘤內注射樹突狀細胞對C6膠質瘤抑制作用的實驗研究

續 嶺 謝明祥 唐懷波 張 平 張 永 石貴新 劉勝遠遵義醫學院附屬醫院神經外科 遵義 563003

瘤內注射樹突狀細胞對C6膠質瘤抑制作用的實驗研究

續 嶺 謝明祥△唐懷波 張 平 張 永 石貴新 劉勝遠
遵義醫學院附屬醫院神經外科 遵義 563003

目的 通過構建SD大鼠腦膠質瘤模型，成瘤后瘤內注射樹突狀細胞，探討樹突狀細胞對C6膠質瘤的抑制和誘導凋亡作用。方法 30只SD大鼠腦內注射C6細胞，成瘤后隨機分3組。A組：沿原注射部位瘤內注入10μL培養液。B組：同法注入10μL含106個未成熟DC的培養液。C組：同法注入10μL含106個成熟DC的培養液。分析3組大鼠的生存時間；取不同組大鼠的腦內腫瘤，制作冰凍病理切片，染色后鏡下觀察；腫瘤組織制成細胞懸液后細胞爬片，免疫組化檢測Fas在C6膠質瘤細胞中的表達，計算積分光密度值。結果 （1）生存時間：C組載瘤大鼠生存時間長于A、B2組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。（2）腫瘤病理結果：C組腫瘤組織大片壞死區，B組小片壞死區，A組無明顯壞死區。（3）免疫組化：Fas表達，細胞積分光密度值（IOD），C組明顯高于A、B組。結論 成熟DC可誘導C6膠質瘤細胞凋亡，途徑之一可能是增強抗原提呈，提高細胞Fas的表達。

膠質瘤；樹突狀細胞；抑制；Fas

膠質瘤浸潤性生長，手術無法完全切除，放化療的不敏感性，使膠質瘤病人預后較差，樹突狀細胞占主要地位的免疫治療方法值得探索，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C6細胞株，SD大鼠（200g左右雄性），大鼠DC表型流式試劑盒，脂多糖（LPS），集落刺激因子、白介素-4，免疫組化Fas試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建腫瘤模型：腹腔注射水合氯醛后的大鼠固定于定位儀。切皮，取矢狀縫右旁3mm，冠狀縫前1mm交點鉆孔，進針5mm，注射含106個C6細胞的培養液10μL。建模過程死亡1只。

1.2.2 樹突狀細胞的誘導：脊椎脫臼處死大鼠，緩沖液沖洗股骨骨髓腔。獲得的沖洗液加入紅細胞裂解液，加入集落刺激因子、白介素-4，隔日半量換液。培養6d后DC流式細胞：DC表面特異性標記OX62表達＞70％。培養8d經脂多糖誘導48h后DC表面分子標記物MHC-II和CD80、CD86高表達，且高于未經LPS誘導的DC，符合成熟DC特點。

1.2.3 鼠腦影像學表現：注射C6細胞后12d，27只大鼠在接種部位（尾狀核）T2顯示腫瘤樣高信號，2只未見異常信號。27只MRI異常大鼠隨機抽取1只取腦見尾狀核部位有異常組織，病理提示為膠質瘤（見圖4）。

1.2.4 樹突狀細胞注射干預：建模12d，載瘤大鼠（26只隨機分3組）沿原注部位，注射10μL約含106個未成熟DC的培養液。同法C組注射10μL約106個成熟DC，A組注射10μL培養液，迷觀大鼠精神及運動狀態。

1.2.5 病理檢查：載瘤大鼠死亡后取腦腫瘤，腫瘤經固定、包埋、冰凍切片、染色、中性樹脂封固，200倍光鏡下觀察拍照。

1.2.6 細胞爬片及免疫組化：腫瘤組織碎裂成10×105/mL細胞懸液，接種爬片，固定，加入一抗、二抗，DAB顯色，蘇木素復染，酒精脫水，封片，測量細胞積分光密度值。

1.3 統計學處理 數據結果用SPSS 17.0統計軟件進行分析，方法采用單因素方差分析，組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 樹突狀細胞培養6dOX62表達水平

圖2 培養8d未經LPS誘導的樹突狀細胞分子標記物表達水平

圖3 培養8dLPS誘導后樹突狀細胞分子標記物表達水平

圖4 鼠腦MRI表現

圖5 大鼠腦腫瘤

圖6 HE×200倍鏡下觀察

2 結果

2.1 生存時間 26只載瘤大鼠隨機分組：A組9只大鼠，存活時間（19.89±1.69）d；B組8只，存活時間（21.13±1.81）d；C組9只，存活時間（25.11±1.76）d；C組與A、B組分別比較，生存時間差異均有統計學意義（P＜0.05）。A組和B組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。26只載瘤大鼠死亡后取腦，均見腫瘤。形態表現：腦中線移位，腫瘤尚邊界（圖5）。

2.2 病理結果 見圖6。

2.3 免疫組化腫瘤細胞Fas的表達 Fas表達部位主要位于細胞膜及細胞漿，表達強度C組＞B組＞A組。見表2，圖7。

圖7 腫瘤細胞Fas表達

表2 膠質瘤細胞IOD值比較 （±s）

表2 膠質瘤細胞IOD值比較 （±s）

注：Fas半定量檢測：3組積分光密度值比較，P＜0.05

組別 IOD值A組133 6.901 7±156.973 0 B組 164 5.502 6±276.282 6 C組244 4.151 2±331.907 8

3 討論

膠質瘤是中樞神經系統最多發的腫瘤，因其浸潤性的生長方式（尤其是高級別膠質瘤），導致其無法根除。腦內無完整的淋巴系統，加之血腦屏障的存在，一些免疫大分子無法通過BBB（血腦屏障），這些使得腦免疫監管功能低下［1］，免疫系統無法有效鑒別、排除異體成分。膠質瘤細胞產生IL-10、VEGF等可使樹突狀表面的分子表達發生變化的有害因子，其中包括MHC-Ⅱ類分子表達調低［2-3］。膠質瘤局部免疫環境使Fas表達下降，膠質瘤無法完成該路徑凋亡。另外，缺乏IL-12、IFN-γ、穿孔素的鼠易長腫瘤，提示在腫瘤的免疫微環境下機體不能有效的啟動免疫反應［4-8］。

樹突狀細胞未成熟與成熟時期具有不同的功能，未成熟樹突狀細胞有很強的抗原辨別、吞噬能力，成熟樹突狀細胞抗原提呈能力強。樹突狀細胞不直接殺傷異病質，通過識別、提呈抗原，激活CD4+Th和CD8+CTL細胞反應［9］起作用。瘤內注射樹突狀細胞后腦組織中DC含量增加，對膠質瘤的殺傷作用，可能是樹突狀細胞促使機體表達共刺激分子、黏附分子、MHC-Ⅰ和MCH-Ⅱ類分子等。樹突狀細胞提高膠質瘤細胞免疫原性，提升相關因子的表達，增強免疫能力［10］。另外，如為自體回輸方式，腫瘤免疫治療不存在自身免疫反應等不良反應［11］。

腫瘤分泌免疫抑制因子使得腫瘤細胞Fas表達調低，無法完成Fas/FasL誘導的凋亡。某些惡性腫瘤即使能表達Fas，但不一定能啟動Fas/FasL介導下的凋亡［12］，甚至抑制Fas介導的凋亡［13］。成熟樹突狀細胞增強抗原提呈，Fas/FasL介導的凋亡途徑激活，Fas表達增加，引發Caspase酶系級鏈反應引發細胞程序性死亡。樹突狀細胞無直接殺傷作用，通過增強抗原提呈，提高免疫監測，抑制腫瘤。另外，有研究發現，NK等細胞對膠質瘤有殺傷作用［14］，所以DC聯合殺傷細胞對膠質瘤抑制作用的研究還有很大空間。

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（收稿2014-11-12）

R-332

A

1673-5110（2015）13-0035-03

腦膠質瘤患者圍手術期外周血樹突狀細胞亞群變化和意義課題編號：黔科合J字〔2008〕2201

△通訊作者：謝明祥，神經外科，學士，研究方向：腦膠質瘤，E-mail：cba666＠126.com