谷子遺傳轉化體系研究進展

李臻+劉煒+管延安+王慶國+潘教文

摘要：谷子（Setariaitalica）是原產于我國的特色雜糧作物，具有抗旱、耐瘠、耐鹽堿、營養豐富等特點，但其生物技術研究相對滯后。本文綜述了近年來谷子組織培養、再生體系、遺傳轉化方法的研究進展，著重介紹了利用農桿菌介導轉化及再生體系，并對可能影響轉化過程及效果的相關因素進行了闡述。

關鍵詞：谷子；組織培養；農桿菌介導；再生；遺傳轉化體系

中圖分類號：S515.03.2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）04-0134-05

谷子（Setariaitalica）被譽為“五谷之首”，在我國有8000年的栽培歷史，是我國傳統的營養保健食品。據《本草綱目》記載，谷子具有“祛熱、除煩、消食宿”的功效[1]，小米粥在民間更有“代參湯”的美譽。谷子營養價值在谷類作物中最高，且相對均衡，富含蛋白質、氨基酸、維生素以及多種微量元素，其營養價值指標均高于FAO/WHO聯合推薦的必須氨基酸模式，是一種不可多得的天然保健食材[2，3]。

谷子具有耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿的生理特性，在貧瘠土壤和干旱地區生長良好、適應性強、產量穩定[4]。而且，谷子是二倍體自花授粉作物，其基因組較?。s470Mb），生長周期短（50～80d），植株較小[5]，具備作為模式作物的特點。但是，谷子作為一種區域性小雜糧作物，主要在亞洲種植，且以我國為主產國，一直以來存在產量較低，經濟效益相對較差的問題，因此圍繞谷子開展的相關研究，與玉米、水稻等主要農作物相比起步晚，分子生物學研究相對滯后。2012年，我國科學家率先完成了谷子基因組測序工作，為通過基因工程手段進行谷子種質資源改良、提高產量奠定了基礎。目前，建立一套高效的谷子遺傳轉化和再生體系已成為谷子研究的重中之重。結合以往研究基礎，本文對近年來谷子組織培養再生體系和遺傳轉化方法的進展進行了總結，并探討了農桿菌介導谷子轉化中的主要影響因素，為通過分子育種進行谷子品種改良提供一定的依據和借鑒。

收稿日期：2015-01-28

基金項目：山東省自然科學基金項目（ZR2014CQ024）；山東省農業科學院青年基金項目（2014QNM37）

1谷子組織培養及再生

20世紀70年代，日本學者B3en等[6]最早開始谷子的組培研究，他們將處于四分體到單核小孢子期的谷子花藥置于含有2，4-D和KT的Blaydes培養基上，成功誘導出4塊胚性愈傷組織并獲得了再生植株。Rangan[7]將萌發5天種子的中胚軸區切下誘導出結構緊致的愈傷組織，并可再生植株。在我國，許智宏[等]最早用谷子與狗尾草的幼穗作為外植體進行愈傷的誘導，結果顯示，對長度在2cm左右的幼穗進行愈傷誘導效果最好，同時也適宜通過不定芽途徑形成再生植株。Rao等[9]以不同谷子品種的成熟胚為外植體，證明谷子不同品種間再生能力存在差異、之后許多國內外學者以谷子葉片、莖尖、成熟種子、幼胚等多種材料為外植體進行研究，均獲得了再生植株。本課題組在總結前人經驗的基礎上，以谷子成熟胚為外植體進行遺傳轉化的探索，主要選用的為目前已經測序的谷子品種“豫谷1號”，也取得了一定的進展。

大量研究表明，谷子的組織培養與品種、外植體類型、培養基的組成（添加物）、生長調節因子等因素密切相關[10～19]。袁進成等[20]選用“冀谷11”等4個谷子品種，研究不同條件下谷子成熟胚的再生能力及其影響因素，結果表明谷子的再生能力受基因型影響較大，“冀谷11”的再生能力最好；LS培養基適合谷子的愈傷組織誘導；MSB5培養基適合谷子的分化；在碳源的選擇上麥芽糖比蔗糖更易誘導形成優質的愈傷組織，添加山梨醇可以提高愈傷的分化效率；在激素配組上，2，4-D和ZT組合誘導愈傷較好，而NAA和6-BA的組合愈傷分化率較高[20]。根和側芽的頂端分生組織誘導愈傷效率都非常低[21，22]，不適合作為外植體進行組織培養的研究。王節之等[23]進一步研究了常用激素在谷子組織培養中的應用效果，認為2，4-D和KT配合使用能夠有效誘導愈傷組織；6-BA對谷子分化成苗起主導作用；IAA與NAA對谷子幼苗生根無明顯作用。目前，谷子的組織培養多選取不同品種穗分化期的幼穗、成熟胚為外植體材料，結合銨含量較低的培養基進行愈傷誘導分化，但要形成高效的再生體系仍需進一步優化。

2谷子遺傳轉化方法

谷子遺傳轉化方法包括基因槍法、農桿菌介導法、PEC介導法、超聲波介導法、花粉管通道法、子房注射法等。目前，應用較多且較為成熟的方法是基因槍轉化法及農桿菌介導法[5]。

2.1基因槍轉化法

基因槍法的主要優點是沒有明顯宿主限制，可將外源基因直接轉入可再生細胞中，可轉化多種組織和器官。缺點是轉化率較低，導入的外源基因拷貝數較多。

Taylor等[24]最早利用基因槍法進行谷子遺傳轉化，并在愈傷組織中檢測到GUS基因的瞬時表達。O'Kennedy等[25]將將磷酸甘露醇異構酶基因manA轉化到珍珠粟中，并對轉化條件進行了優化。刁現民等[26]以谷子幼穗作為外植體，將pAHC25和pB1121質粒利用基因槍法分別轉化到谷子愈傷中，通過檢測質粒中GUS基因的瞬時表達情況，分析了影響谷子愈傷組織轉化的因素，建立了JQ-700基因槍轉化的最佳方法：即鎢粉3μg/mg、CaCl21.5mol/L、亞精胺40mmol/L，基因槍轉化室高度7cm，轟擊速度400～450m/s，轉化愈傷組織用量為1～2g。在此條件下，刁現民等[27]以豫谷1號為材料，獲得了能夠穩定表達抗除草劑基因Bar的轉基因植株。

研究表明，基因槍法轉化效率主要受啟動子類型和選擇標記的影響。Taylor等[10]通過研究谷子懸浮培養細胞和未成熟胚中CaMV35S啟動子和玉米Ubiquitin啟動子瞬時表達GUS基因的效率，比較了這兩種啟動子在谷子中表達活性的差異，結果顯示，玉米Ubi啟動子的活性在懸浮培養細胞中比35S啟動子高5倍多，在未成熟胚中高2倍多，表明玉米Ubi啟動子相對于35S啟動子更適合谷子的遺傳轉化。這與刁現民等[28]的研究結果相同。新霉素磷酸轉移酶（NeomycinPhosphotransferseⅡ，NPTⅡ）基因是轉化中常用的選擇標記基因，該基因的編碼產物可以使卡那霉素失活，因此在培養基中添加卡那霉素可以用于篩選陽性再生植株，但是長期在卡那霉素的壓力下會導致愈傷組織胚狀體分化效率降低甚至使后代不育。董云洲等[29，30]用基因槍法轉化谷子花粉和未成熟幼穗，在進行卡那霉素篩選過程中發現植株分化受到嚴重影響。潮霉素B和除草劑Basta是水稻遺傳轉化中常用的篩選劑，Lambé等[31]的研究顯示，利用潮酶素B篩選轉基因植株，對愈傷分化的影響較小，可獲得可育植株。Girgi等[13]利用基因槍法將含有Bar基因和GUS基因的載體轉化到4個谷子品系（842B、7042、MangaNara、BongoNara）中，成功篩選到轉基因株系5株。endprint