山東葡萄霜霉病菌致病力分化及親緣關系研究

張眉+辛相啟+吳斌+王升吉+郭霞+趙玖華

摘要：為明確山東地區葡萄霜霉病菌株的致病性及親緣關系，本研究以不同抗性的6個葡萄品種作為鑒別寄主，采用葉盤接種法，對采自山東地區的13個葡萄霜霉病菌株進行致病性測定，并擴增每個菌株的rDNA-ITS序列進行同源性分析。結果表明，這13個葡萄霜霉病菌株均有致病性，據致病力分為強、中、弱3種致病類型，中等致病型菌株占優勢，菌株間致病力差異與菌株的地域來源無明顯相關性序列比對及系統發育樹分析表明，這13個葡萄霜霉病菌株的親緣關系很近，rDNA-ITS序列同源性高達99.94%，菌株間致病力差異與rDNA-ITS序列多態性不相關。

關鍵詞：葡萄霜霉病菌；致病力分化；rDNA-ITS；親緣關系；山東

中圖分類號：S436.631.1+9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）04-0095-05

葡萄霜霉病是一種世界性病害，在我國已遍布各葡萄產區，可導致年減產30%～50%[1]。葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola（Berk.&Curt.）Berl.&deToni]的致病力是否存在分化在國內外的研究中一直存有分歧。劉旭等[2]研究表明來自重慶和陜西2個地區的葡萄霜霉病菌致病力沒有顯著差異；Boubals[3]卻發現不同來源的葡萄霜霉病菌可以表現出不同的致病力。目前由東葡萄霜霉病菌的致病力分化研究還未曾有報道，因此，本研究將采自山東地區13個不同霜霉病菌株接種于6個不同抗性葡萄品種進行致病性測定，以明確葡萄霜霉病菌的致病性特點，為該病菌的致病機制及病害流行規律研究奠定基礎。

收稿日期：2014-12-01

基金項目：公益性行業（農業）科研專項（201203035）

核糖體內轉錄間隔區（internaltranscribedspace，ITS）因在真核生物種內相對保守，種間差異顯著，常用于真菌物種的分類鑒定以及系統發育關系研究。賈姝等[4]利用rDNA-ITS序列分析發現，遼寧地區不同葡萄霜霉病菌株間具有一定的遺傳分化；張勝菊等[5]分析了大白菜與甘藍寄生霜霉菌的rDNA-ITS序列，表明兩者均與甘藍型油菜霜霉病菌有較近的親緣關系。本研究從分子水平上對山東不同葡萄霜霉病菌株的rDNA-ITS序列進行比較分析，對探明該病菌的親緣關系等遺傳進化研究有重要意義。

1材料與方法

1.1供試材料

在山東地區采集的13個不同葡萄霜霉病菌株，見表1。

供試鑒別寄主為6個不同抗性的葡萄品種，分別是摩爾多瓦、夏黑、赤霞珠、玫瑰香、貴妃玫瑰和紅提。

1.2生化試劑及其他

EasyTaq酶購自北京全式金公司，DNA凝膠回收試劑盒購自上海Sangon，其他常規化學藥品為分析純試劑。PCR引物合成和DNA測序均由上海Sangon完成。

1.3葡萄霜霉病菌的室內接種

1.3.1接種物與寄主植物的準備從田間采集新鮮的葡萄霜霉病葉，在流水下用毛筆刷掉病斑上老的霉層，將病葉放于人工氣候培養箱中，22℃、相對濕度（RH）90%、光照黑暗各12h交替培養，待長出新的白色霉層時，取孢子囊梗及孢子囊至無菌水中，充分吸打后，將孢子囊懸浮液濃度稀釋至1×105個/mL，用于接種。

選取葡萄當年生枝條自上向下第3～4節位健康無病葉片，清水洗凈后，用內徑15mm的打孔器打取葉盤。在直徑90mm培養皿底鋪1層濾紙，加入2mL無菌水，將葉盤葉背朝上放入培養皿中，每皿隨機放入10個葉盤作為1個重復，每個菌株每個寄主品種重復3次。

1.3.2接種及病情調查采用葉盤接種法接種。用微量移液器吸取稀釋好的孢子囊懸浮液滴加在葉盤中央，每個葉盤接種20μL。清水作對照。接種后，將培養皿放于人工氣候培養箱內，22℃、RH90%、光照黑暗各12h交替培養。培養48h后，用吸水紙吸去葉盤上的接種液，相同條件下繼續培養。接種7d后，計算各處理的病情指數。利用DPS軟件中的系統聚類，采用卡方距離法計算各處理間的聚類距離，用離差平方和法進行聚類分析[6]。

相關計算方法及標準劃分為：（1）發病率（%）=（發病葉盤數/總葉盤數）×100。（2）參考劉旭等[2]的研究劃分病情分級標準，并稍加改動：0級，無病斑；1級，病斑面積占葉盤面積5%以下；3級，病斑面積占葉盤面積5%～20%；5級，病斑面積占葉盤面積20%～50%；7級，病斑面積占葉盤面積50%以上。病情指數=∑（各級發病葉盤數×相對級值）/（調查總葉盤數×7）×100。（3）抗性類型：高抗（HR），病情指數為0～5.0；抗病（R），病情指數為5.0～25.O；感病（S），病情指數為25.0～50.0；高感（HS），病情指數為50.0～100.0。

1.4葡萄霜霉病菌基因組的提取

取1.5mL離心管，加入適量的95%乙醇，用尖頭鑷子夾取新鮮的葡萄霜霉病菌孢子囊梗及孢子囊于乙醇中，4000r/min離心10min，去上清液，收集霜霉病菌。參考穆春華等[7]的方法提取葡萄霜霉病菌的基因組DNA。

1.5葡萄霜霉病菌rDNA-ITS序列的擴增與分析

以葡萄霜霉病菌基因組DNA為模板，用引物ITS1F：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'擴增rDNA-ITS序列。PCR擴增條件為94℃預變性4min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min20s，35個循環；72℃終延伸10min。切膠回收目的片段，送測序公司測序。

通過DNAMAN軟件和Clustalx1.83軟件對rDNA-ITS序列進行比對，利用MEGA5.0分析軟件中的Neighbor-Joining分析法構建系統發育樹。endprint

2結果與分析

2.1不同葡萄霜霉病菌株的致病力

通過葉盤接種法將13個不同葡萄霜霉病菌株分別接種在6個鑒別寄主葡萄上，對菌株的致病性進行測定。接種7d后，發病嚴重的可在葉盤接種處出現較大病斑，并有大量白色霉層產生（圖1A）；發病輕者沒有病斑或僅可見褐色侵染點，極少或不產生白色霉狀物（圖1B）。從表2可以看出，供試13個葡萄霜霉病菌株均有致病性。但是，當13個菌株同時接種抗病性較強的夏黑品種時，從病情嚴重度來看，接種JYrf和BZdd的病指僅為0.48，而接種JYsg.DZln、DZhw和DZSdyj的病指卻都達到50.00以上；從抗性反應來看，出現了高感、感病、抗病和高抗4個類型。接種高抗病品種摩爾多瓦也表現出了相似的發病特點。同時，當寄主為感病性較強的貴妃玫瑰和紅提品種時，病指范圍分別為28.57～79.05和27.62～77.62，病指差均在50左右。由此可以得出，山東葡萄霜霉病菌株間存在著明顯的致病力分化。

對供試菌株的致病力進行聚類分析，可以看出（圖2），13個菌株大致可聚為3組，第1組是致病力較強的菌株，為DZhw、DZln、JYsg和DZS-dyj，占30.8%；第Ⅱ組是致病力中等的菌株，為JNzg、XTyjz、MYxz、DZSdt、PYwt和QDnlk，占46.2%；第Ⅲ組是致病力較弱的菌株，為JYrf、BZdd和DYmt，占23.1%。因此，將13個菌株可劃分為強、中、弱3種致病類型，其中，中等致病型菌株為優勢菌株。

從圖2還可以看出，JYrf的致病力最弱，而同樣是采自濟陽縣的JYsg致病力最強，所以，地域來源很近的菌株可以表現為不同的致病型；同時地域來源較遠的菌株JNzg、MYxz和QDnlk又可以聚在一起，均為中等致病型。因此，山東葡萄霜霉病菌致病力差異與菌株的地域來源無明顯相關。

2.2供試葡萄霜霉病菌株的親緣關系

對13個葡萄霜霉病菌株的rDNA-ITS序列進行Blast比對分析，結果顯示，所有菌株與登錄號為DQ665668.1的葡萄霜霉病菌高度同源，同源性均為99%。因此，這13個霜霉菌株與已知葡萄霜霉病菌DQ665668.1的親緣關系很近，屬于同一個種。進一步比對發現，13個菌株間的同源性可高達99.94%，其中，JYrf、DZhw、DZSdyj、DYmt和MYxz的同源性為100%，DZln和QDnlk有4個堿基位點發生變異，其他菌株有1～3個堿基變異位點。由此可以得出，采自山東地區的13個葡萄霜霉病菌株之間的親緣關系很近，但rDNA-ITS序列間仍然存在一定差異。

根據以上序列共同構建系統發育樹，從樹形結構可以看出（圖3），JYrf、DZSdyj、DYmt、PYwt、MYxz和DZhw與已知葡萄霜霉病菌DQ665668.1的親緣關系最近，聚在同一分支內，同源性為99.98%。同為來自青島地區的DZSdyj、DZSdt和QDnlk菌株分散地聚在了不同的分支中。由此可以得出，葡萄霜霉病菌株間的親緣關系遠近與菌株的地域來源無相關性。

2.3葡萄霜霉病菌株致病力差異與rDNA-ITS序列多態性的關系

為了明確葡萄霜霉病菌株間致病力的差異是否與rDNA-ITS序列的差異有關，對致病力（圖2）及系統發育（圖3）進行了綜合分析，可以得出，在強致病力菌株中，DZhw和DZSdyj的同源性為100%，與JYsg的遺傳距離較遠，rDNA-ITS序列差異較大；在弱致病力菌株中，JYrf和DYmt的同源性為100%，而BZdd則聚在了其他進化分支內。即使JYrf、DZhw、DZSdyj、DYmt和MYxz的rDNA-ITS序列完全一致，致病力也表現出了強、中、弱的差異。因此，葡萄霜霉病菌株間的致病力差異與rDNA-ITS序列的多態性無相關性。

3結論與討論

致病性測定是真菌研究中的重要環節，可為真菌的遺傳多樣性、致病相關基因、致病機制等研究提供依據，因此，病原菌的接種技術是這些研究的關鍵所在。本研究發現，孢子囊在22℃下1h即可萌發，24h萌發率約為50%。有研究報道[8.9]，葡萄葉片氣孔對游動孢子具有向性引力，游動孢子釋放后會向氣孔游動，約半小時后停止游動形成休止孢，長出芽管從氣孔侵入。因此，我們選擇剛收集到的新鮮孢子囊用于接種，以利于游動孢子在釋放后迅速游動到氣孔附近進行侵染，保證侵染活性及測定結果可靠性。在前期試驗中對孢子囊的接種濃度也進行了摸索，發現濃度低時侵染率較低，而高濃度更利于發病，最終選用1×105個孢子囊/mL作為病菌的接種濃度，這也與Polesani等[10]、Díez-navajas等[11]和Liu等[12]在研究中所使用的孢子囊量相近，可以實現較好的發病效果。

葡萄品種的抗病性不隨霜霉病菌菌源的改變而改變[13]，因此我們在前期室內、田間接種試驗的基礎上，挑選出6個不同抗病性且在山東地區較為普遍種植的葡萄品種作為鑒別寄主。本研究結果表明，13個葡萄霜霉病菌株均具有致病性，并且存在明顯的致病力分化，由此推測，有不同生理小種的存在，這Boubals[3]的研究發現相一致。此外，李華[14]的研究結果也表明，不同霜霉病菌株接種不同抗性葡萄品種，菌株間表現出了致病力差異，但不存在寄主-病原間的特異性互作，由此提出了葡萄與葡萄霜霉菌之間的水平系統學說，同時，他還認為，葡萄霜霉病菌的致病力差異首先表現在其孢子囊大小和其中所含細胞核數量的差異，換言之，就是霜霉菌的異核現象引起了致病力的不同[15]。研究中我們還發現，有些菌株在接種抗病性較強的摩爾多瓦和夏黑時，葉盤上特別是接種點處會出現褐色點狀侵染斑（圖1B），鏡檢發現這些變色組織主要集中在氣孔周圍，此前有相關報道認為抗病葡萄葉片在受到霜霉菌侵入時會在氣孔周圍形成胼胝質沉積物[16]，這一物質會穿透寄主細胞形成一道屏障從而阻止侵染菌絲進一步展[9]，同時還會阻斷吸器與寄主細胞之間的物質交換[17]，所以這些侵染斑可能是因胼胝質的阻礙使得生長受到局限的霜霉菌引起的癥狀。但相對于出現以上侵染表型的菌株，JYsg、QDnlk和MYxz仍然可以在摩爾多瓦葉盤上長出較多霉層，因此該病菌的致病機理還需進一步研究。

目前，rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌的分類鑒定、種間親緣關系研究、植物病原真菌檢測等方面已得到廣泛應用。為了弄清這13個葡萄霜霉病菌株的親緣關系，我們對它們的rDNA-ITS序列進行了Blast分析，結果表明這13個菌株與GenBank中的DQ665668.1葡萄霜霉病菌高度同源，同源性均為99%，而且菌株間的同源性可高達99.94%，差異菌株只發生了個別堿基位點的變異。這與賈姝等[4]的研究結果相一致，他們在遼寧地區采集了21個葡萄霜霉病菌株，這些菌株也都與DQ665668.1葡萄霜霉病菌高度同源，并且菌株間的遺傳距離很近。這些都說明，rDNA-ITS序列在葡萄霜霉病菌的種內是非常保守的，這將為該病菌的遺傳進化研究提供參考。endprint