響應面法優化枯草芽孢桿菌NS178產芽孢發酵工藝

王西祥+丁延芹+杜秉海+姚良同+祁國振+葛科+劉凱

摘要：應用單因素設計法對影響內生枯草芽孢桿菌NS178發酵液菌落數的因子進行篩選，得到3個主要影響因子，分別為葡萄糖、（NH4）2SO4、K2HPO4。采用Box-BehnkenDesign法對發酵培養基進行優化，通過響應面法分析獲得最佳配方為葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%。對溫度、初始pH值、裝液量3組培養條件進行優化，最佳條件為33℃、pH7.6、50mL。在最佳配方和培養條件下，NS178發酵液菌溶數為34.50×108cfu/mL；培養72h時芽孢率達到75.8%；優化后比優化前發酵液抑菌圈直徑增加67%。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；芽孢；響應面；抑菌圈

中圖分類號：S144文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）04-0059-07

微生物肥料又稱菌肥或生物肥料，是一類以微生物生命活動及其代謝產物使農作物得到特定有益肥料效應的微生物活體制品[1]。微生物肥料在培肥地力，保護環境，抑制農作物對硝態氮、重金屬、農約的吸收，凈化和修復土壤，促進農作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用以提高生物質利用率、降低農作物病害發生，以及提高農作物產品品質和食品安全等方面已表現出不可替代的作用[2]，符合環境保護、食品安全和人類健康的需要[5]。微生物肥料的施用能夠調節土壤微生物生態，使其向著健康方向發展[4]，促進植株吸收營養元素，產生抗生素等多種物質抑制細菌或真菌性病害，誘導系統抗性間接促進植物生長，增強植物抗逆性，提高宿主的抗性和減緩pH值變化等能力[3]。

收稿日期：2014-12-18

基金項目：農業部公益性行業科研專項經費項目（200903018）

芽孢桿菌（Bacillussp.）在自然界廣泛存在，其抑菌物質復雜多樣，具有較廣抑菌譜[6]。研究芽孢桿菌對植物病害的防治作用，對于開發微生物菌劑有著十分重要的意義?？莶菅挎邨U菌（Bacillussubtillis）是目前研究最為熱門的抑菌微生物，不僅在防治多種植物病害方面具有獨特優勢，而且還能促進作物生長、增加產量、增強植物抗逆性等，國內外均有產品登記注冊[7，8]。B.subtilis168作為第一株全基因組測序完成的革蘭氏陽性菌，具有生物安全性，為研究細胞分化的模式微生物[9]。枯草芽孢桿菌所產芽孢耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑等，在工業機械化生產及高溫干燥過程中，可以保讓微生物菌劑的活性，提高其產品質量[10]。不同枯草芽孢桿菌在抑菌譜、抑菌效果及抑菌機制等方面有較大差異，因此篩選出存活率高、繁殖速度快且具有較強抗菌能力的枯草芽孢桿菌仍是目前研究的重點[11]。

生物菌劑的制備過程中存在發酵菌落數偏低、芽孢生成率較低的問題，且優化培養基組成是一個長期復雜的過程，涉及大量的數據分析處理。響應面法（responsesurfacemethodology，RSM）克服了傳統的單因素試驗次數多、試驗周期長和結果不準確的缺點，已被成功應用于培養基和培養條件的優化[12]。本文采用單因素試驗設計方法，對影響枯草芽孢桿菌NS178發酵液菌落數的相關組分進行初步優化，通過Box-Behnken（B-B）設計進一步優化了發酵配方，確定了最優培養條件，以期為枯草芽孢桿菌肥料的開發提供可靠的理論依據，為工業生產生物菌肥提供參考。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試菌：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtillis）NS178，由本實驗室保存。

指示菌：生姜莖腐病原菌（Pythiumsp.），由本實驗室分離保存。

1.2供試培養基

菌種活化培養基（LB培養基）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。

發酵基礎培養基（豆芽汁培養基）：黃豆芽200g，蔗糖20g，蒸餾水1000mL。

抑菌物質生測培養基（PDA培養基）：馬鈴薯100g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。

1.3菌種種子液的制備

將斜面保存的供試菌NS178接種到LB平板上，37℃恒溫箱培養24h。接種環挑取一環接種到裝有液體LB培養基的試管中，37℃、180r/min搖床培養，分光光度計法測定不同時期菌液的OD600值，繪制標準曲線，由此確定適宜種齡進行后續試驗。

1.4最優培養基影響因素的獲取

選取碳源、無機氮源、無機鹽共12個因素做單因素試驗，每因素設計4個水平，詳見表1。以豆芽汁培養基（黃豆芽100g，蔗糖20g，水1L）為對照。重復4個。菌種種子液的接種量為2%（體積比），31℃、180r/min搖床培養24h先確定最佳碳源及其水平，在此基礎上，確定最佳無機氮源及水平，最后確定最佳無機鹽及水平。單因素試驗均用活菌計數法測定的菌落數為指標，確定最優培養基的影響因素。

1.5最佳培養基的確定

根據單因素試驗的結果，Box-Behnken模型以葡萄糖（x1）、（NH4）2SO4（x2）和K2HPO4（x3）濃度為自變量，以菌落數為響應值，設計響應面試驗擬合自變量與響應值之問的函數關系。按下面公式進行編碼轉換：

X1=（x1-2）/1；X2=（X2-0.3）/0.2；X3=（x3-0.2）/0.1式中：X1、X2、X3為不同試驗因素的編號，見表2。

試驗設計與數據分析均為Design-Expert7.0軟件提供。

將初始培養基和預測的最佳培養基進行培養試驗，驗證模型的準確性和有效性，重復3次。

1.6培養條件的優化

在獲得最佳培養基配方的基礎上，對培養條件進行優化。試驗設6組初始pH值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，進行初始pH值對菌落數的影響試驗；在250mL三角瓶中分別加入50、75、100、150mL液體培養基，進行需氧量試驗；將培養溫度調節為28、31、33、35、37℃，進行培養溫度對菌落數的影響試驗。培養條件優化菌落數以活菌計數法測定。endprint

1.7最佳培養基和最佳培養條件下的培養

1.7.1菌落數的測定（活菌計數法）無菌條件下將發酵液稀釋至10-6、10-7、10-8，吸取200μL于無菌平板中，每個梯度重復3次。倒置平板于37℃培養箱中培養，20h后取出計數。

1.7.2芽孢率的測定將菌液培養24h后，每隔12h測定一次芽孢數。芽孢率的測定方法為：80℃水浴加熱15min后，用稀釋涂布法檢測芽孢生成量[13]。

1.7.3抑菌物質效價的測定指示菌菌懸液的制備：將活化的生姜莖腐病病原菌涂布于PDA平板上，28℃培養4d。刮取一環菌絲體置于5mL無菌水中，振蕩均勻，制成菌懸液。

生測平板的制備：將5mLPDA培養基倒入培養皿中，凝固后，用鑷子夾取一個牛津杯置于培養皿中央。PDA培養基冷卻至50～60℃，加入1mL指示菌菌懸液，混勻后倒入培養皿上層，置28℃培養箱中培養4d。

效價的測定：采用牛津杯法[14]。發酵液10000r/min離心5min后，取上清液加入牛津杯中（50μL/孔），28℃培養4d，十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑計算其效價。

2結果與分析

2.1NS178生長曲線

根據不同時期測定的OD600值繪制生長曲線，如圖1所示。接種時菌液OD600值為0.150；培養12h時OD600值為0.623；培養24h時OD600值為2.013，此段時間生物量快速增長，菌落數較12h時增加14倍，為對數期；24～36h時，菌落數保持不變，為穩定期。因此，選擇對數中后期（即20h）的菌作為菌種，進行培養基組成的優化。

2.2最優培養基影響因素

根據單因素試驗設計，活菌計數法測定菌落數，不同物質及其水平對應的結果見表3。篩選的最優影響因素是葡萄糖、（NH4）2SO4和K2HPO4。

2.3最佳培養基

根據Box-Behnkon試驗設計原理，進行3因素3水平響應面分析試驗，獲得17個試驗點的菌落數如表4。17個試驗點可以分為2類：其一為析因點，自變量在X1、X2、X3組成的三維頂點，總計12個析因點；其二為零點，即區域中心點，中心點試驗重復5次，用于估計試驗誤差。

用標準多項式回歸方法擬合，獲得響應值與自變量關系的二次多項式：

式（1）中：Y為預測響應值即發酵液菌落數，方差分析見表5。

由表5可知，所選模型的不同處理間差異極顯著，說明回歸方程描述應變量與自變量之間的線性關系顯著，試驗方法真實可靠。X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22、X32的P值均小于0.05，說明這些因素對模型顯著。失擬項0.56>0.05，失擬項差異不顯著，說明該方程對試驗擬合性較好，試驗誤差小。該模型的R2=0.9931，=0.9843，自變量和響應值之間線性關系達到顯著水平，因此可以利用該回歸方程確定最佳發酵條件[15]。

根據上述回歸方程及回歸模型方程分析表繪出雙因子效應分析圖和相應等高圖（見圖2、圖3和圖4），可知，當K2HPO4濃度不變時，菌落數隨著葡萄糖和（NH4）2SO4濃度的增大呈現先增大后減小的趨勢.且葡萄糖增加速度較快；當（NH4）2SO4濃度不變時，菌落數量隨K2HPO4濃度的增大呈緩慢增加趨勢，葡萄糖增加速度較快，且呈現先增加后降低的趨勢；當葡萄糖濃度不變時，隨著（NH4）2SO4和K2HPO4濃度的增高，菌落數呈現先增大后降低的趨勢，過高濃度的（NH4）2SO4和K2HPO4均不利于菌體的生長。

將式（1）分別對各自量（X1、X2、X3）求一階偏導數并均令其為0，即可得到一個三元一次線性方程組，解此方程組得到模型預測最佳點為：葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%，代入回歸方程，得到理論菌落數Y=32.50×108cfu/mL。

2.4模型的驗證結果

由6可知，驗證平均值與預測值相吻合，證實了模型的準確性。響應面法獲得最佳培養條件是可行的，菌落數可以真實反映3個影響因素對菌落數的影響。優化后發酵液菌落數為33.12×108cfu/mL，較優化前提高5.83倍。

根據《中華人民共和國農業行業標準—微生物肥料》（NY227-94）的規定，用于微生物肥料的液體成品指標中，有效活菌落數為5×108～10×108cfu/mL，雜菌落數<5%。優化后發酵液菌落數滿是微生物肥料的要求，適用于有益微生物制成的、能改善作物營養條件的活體微生物肥料制品。

2.5最佳培養條件

測定6個初始pH值對菌落數的影響（圖5），發酵培養基初始pH值為6.0～7.5時與菌落數呈正相關，7.5～8.5時呈負相關；枯草芽孢桿菌NS178的最適宜初始pH值為7.5，細菌總數為31×108cfu/mL。過高或過低都不利于菌體增殖，

250mL三角瓶的裝液量為50、75、100、150mL所得活菌落數如圖6所示，菌落數隨著裝液量的增加而逐漸減少，以每瓶裝液量50mL產量最高，說明該菌株為好氧菌，發酵過程中要求較好的通氣條件。雖然沒有設置裝液量低于50mL試驗，但是250mL三角瓶內裝液量過少可能由于過度蒸發而改變培養基各組分的濃度，產生較大的試驗偏差，也會因發酵液體積過少而導致發酵規模的縮小，實際意義不大，因此選擇50mL作為最佳裝液量，此時菌落數為33×108cfu/mL。

圖7顯示，33℃以下溫度不利于菌體增殖，當溫度為33℃，菌落數達到最大值，為34.5×108cfu/mL，此后隨溫度升高呈下降趨勢。

2.6最佳培養基和培養條件對茵落數和芽孢率的影響

優化培養條件后，24h菌落數為34.50×108cfu/mL，為優化前近7倍；72h時芽孢數為26.75×108cfu/mL，芽孢率達到75.8%，結果如圖8。endprint

2.7最佳培養基和培養條件下發酵液的抑菌效果

優化前發酵液的抑菌圈直徑為12.56mm，優化后發酵液的抑菌圈直徑為20.93mm。優化后較優化前增加67%，優化后的發酵液能產生更多抑菌物質，拮抗效果如圖9所示。

3討論

本試驗采用單因素試驗設計從影響菌落數的12個因素中，確定葡萄糖、（NH4）2SO4、K2HPO4為最重要的影響因素。為了合理簡便地尋找響應面試驗中心點，進一步采用Box-BehnkenDesign響應面法分析，得出回歸模型最優組合為葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%。模型預測的最大菌體濃度為32.50×108cfu/mL，驗證值為33.12×108cfu/mL，與預測值相差1.91%。實測值和預測值之間較好的吻合性顯示了所建模型的精確性和可靠性。

本試驗還通過搖瓶發酵研究了初始pH值、溶氧水平以及溫度對枯草芽孢桿菌菌落數形成的影響。初始pH值對菌落數的生成有很大影響，在初始pH為7.5時，菌落數最多，過酸或過堿都不利于菌落形成。溶氧水平試驗中，菌落數隨著裝液量增加而降低，最佳裝液量為50mL，隨著液體體積的增加，細菌供氧不足，不利于好氧菌株NS178菌落數的增加。趙達等[16]利用單因素篩選和均勻設計試驗對枯草芽孢桿菌B03液體發酵條件為：500mL三角瓶裝液量50mL，初始pH值6.0，發酵溫度35℃，搖床轉速180r/min，發酵周期60～66h，與本試驗結論基本相符。

芽孢并不是細菌生活史中不可缺少的部分，只是產芽孢細菌在生長過程中形成的一種抗逆性休眠體，它的形成受很多因素的影響，包括營養物質、環境因素等[18]。芽孢形成是一個受基因控制的極其復雜的過程，已發現枯草芽孢桿菌至少有50個基因與芽孢形成有關，大致分布在染色體的5個區段中，按照一定的方向和順序表達，分別控制芽孢形成過程的不同階段。2，6-吡啶二羥酸（DPA）是芽孢的特有成分，在母細胞中與Ca2+結合形成Ca2+-DPA復合物，在降低芽孢核含水量和增強芽孢耐熱性上起著重要作用[19]。豆芽汁培養基可以為芽孢的形成提供大量的Ca2+，促進芽孢形成。K+能促進B.megaterium、B.cereus形成芽孢[20]。從表7的對比結果可知，本試驗獲得的芽孢數、芽孢生成率和容積生產率明顯高于國內外水平。

在同一培養基中，菌株生長量與其抑菌物質分泌呈正相關，菌株抑菌物質是在菌株生長過程中分泌的代謝產物，內生拮抗細菌BS-2對植物病害的防治作用是由菌體在植物體內的內生定殖和分泌抑菌物質共同作用的結果[2]。生防菌分泌的抑菌物質種類多樣，濃度高低和代謝條件也不盡相同。劉雪等[2]研究發現抑菌物質為蛋白質，可以抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發，并使部分孢子萌發畸形。盧彩鴿等[23]發現利迪鏈霉菌A01活性代謝產物那他霉素對甘藍枯萎病菌絲生長和分生孢子萌發均有明顯的抑制活性，通過增加膜的通透性引起菌絲細胞的形態和內部結構的病變。

本試驗對枯草芽孢桿菌NS178的培養基及培養條件進行了搖瓶發酵的初步探究。為了獲得更多可靠的數據，需要進一步研究NS178對指示菌的拮抗機制，并研究發酵罐中芽孢形成的最適宜條件，為大型工業發酵生產提供參考。endprint