骨橋蛋白OPN在哺乳動物生殖上的作用及在生豬生產應用上的展望

葉 超，陳志林，馮美瑩，衛恒習，張守全

（華南農業大學動物科學學院，廣州 510642）

骨橋蛋白OPN在哺乳動物生殖上的作用及在生豬生產應用上的展望

葉 超，陳志林，馮美瑩，衛恒習，張守全

（華南農業大學動物科學學院，廣州 510642）

骨橋蛋白(osteopontion，OPN)是細胞外基質中的一種分泌性糖基類酸性蛋白質，富含天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸。有研究表明，骨橋蛋白在雌性、雄性哺乳動物生殖系統中廣泛表達，與哺乳動物的生殖機能息息相關。它不僅影響子宮內膜容受性的建立、胚胎的著床，且在精卵融合過程中發揮著至關重要的作用。就OPN在哺乳動物生殖上的相關作用和機理進行了綜述，并對該蛋白今后在生豬生產上的應用進行展望。

骨橋蛋白；精卵融合；胚胎著床；子宮內膜容受性建立

1 OPN與雄性哺乳動物生殖

骨橋蛋白相對分子質量大小在25KD～80KD。它于1979年被Senger首次發現，在而后的幾十年國內外學者相繼在骨、肺、肝、膀胱、乳腺、睪丸、骨髓和蛻膜等組織結構中發現這種蛋白質。最近的研究結果表明該蛋白質參與腫瘤惡化、骨基質的礦化和吸收、組織創傷修復等生理過程，且在心血管系統、免疫系統、消化系統及泌尿系統中扮演著重要的角色。骨橋蛋白是機體內多種組織細胞均能合成并分泌的一種重要的分泌性細胞因子，其作為細胞外基質中的一種重要的非膠原蛋白，具有多種生理作用。目前研究發現，OPN蛋白在哺乳動物生殖系統中廣泛存在，與雄性哺乳動物的生殖機能息息相關。

1.1 OPN在雄性哺乳動物生殖系統中的分布與表達

Killian等人[1]通過應用雙向電泳和質譜技術，在具有高繁殖性能的荷斯坦公牛個體精清上發現了OPN，并初步確定OPN于荷斯坦公牛的繁殖性能有關；隨后，Hammerstedt等人[2]通過雙向電泳蛋白質圖譜比對分析，最終確定OPN是一種與受精能力有關的蛋白。另外，OPN蛋白通過免疫印跡的方法在對馬的研究上，也確定了OPN與馬的繁殖力有關[3]。

Luedtke等人[4]應用免疫細胞化學的方法發現，大鼠從出生開始一直到發育成熟，其睪丸、附睪、輸精管均有OPN蛋白表達。而且在睪丸組織中，OPN主要表達于精原細胞至早粗線期的精母細胞中；在附睪中，OPN主要在無纖毛細胞中表達；在附睪中，OPN蛋白的表達顯現出特定區域性及特定細胞性。相比之下，公牛的OPN蛋白最早發現于牛精液中。隨后有學者通過Western印跡的方法，分別在精囊、輸精管壺腹部檢測到OPN的表達，由于得到的OPN 分子質量與精清中的OPN 分子質量一致，故認為精清中的OPN可能來源于精囊或者輸精管壺腹部[4]。Novak S[5]等人研究發現公豬的生殖系統內亦有OPN蛋白的表達。Taekyun Shin等人[6]用兔抗人OPN抗體對豬睪丸進行Western Blot檢測后，發現在1日齡的公豬睪丸上只存在66kD的OPN蛋白，在6月齡的公豬睪丸上分別存在32kD和66kD的2條OPN蛋白帶，同時通過免疫組織化學檢測后，發現不同階段的精母細胞上存在OPN，在支持細胞上也有少量的OPN表達，然而晚期精子細胞和成熟的精子細胞上卻沒有發現OPN的表達，這些發現暗示著OPN能在大多數的生殖細胞上檢測到，且OPN可能參與精子的發生與形成過程。Souza等人[7]通過免疫細胞化學技術，在狗的生殖系統上也發現了OPN蛋白的表達。

綜上所述，OPN廣泛表達于雄性哺乳動物生殖系統中，如睪丸、附睪、前列腺、輸精管等。但OPN蛋白的表達量因動物種屬、動物個體甚至相同個體不同時期而不同。根據目前的研究數據顯示，OPN蛋白的表達量與哺乳動物的繁殖力密切相關，但其中的具體分子機制尚需深入研究。

1.2 OPN對哺乳動物精子受精的影響

OPN蛋白含有精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，該序列在不同物種的OPN中普遍存在，對OPN發揮黏附功能起著至關重要的作用。RGD序列為高度保守的特異性細胞黏附功能閾，該序列可特異性地與細胞表面整合素受體 αvβ、αvβ3、 αvβ5、β3等結合，參與糖蛋白與細胞間的黏附過程，引起局部黏附，改變細胞骨架，促進細胞遷移。RGD序列具有高度保守性，一旦變異或缺失將喪失其促黏附的功能[8，9]。

受精對個體的遺傳基因傳遞起著至關重要的作用，同時也預示著一個新生命的誕生。在哺乳動物中，受精起始于精子與卵子的直接相互作用，這個過程由一系列的四旋蛋白、整合素、解離素和金屬蛋白起著調控作用。而卵子上的整合素很有可能與精子OPN發生結合[10]，從而介導精卵融合(圖1)。但具體的精卵融合機理目前還沒有研究透徹。

圖1 骨橋蛋白OPN在受精過程中的作用

精卵融合受精是哺乳動物發育的基礎，有活力的精子是受精的先決條件。在精子的運動、獲能、受精、與卵子的融合、以及后期的胚胎發育等過程中，精子上的蛋白質起著至關重要的作用。如果精子上的某些蛋白缺失可造成人類生育能力下降甚至是不育[11]。根據已有的數據顯示OPN蛋白與精子的活力、畸形率等息息相關。Killian等人通過抗牛OPN抗體進行對牛的體外受精實驗，結果顯示，被抗牛OPN抗體作用以后的精子與卵子，體外受精能力顯著下降，這說明了OPN可能介導了牛精子和卵子的融合過程[12]。此外OPN在減少多精入卵上也發揮著重要的作用，Erikson等人[13]通過體外受精實驗，在受精體系中加入OPN抗體后發現，精子受精率明顯降低，但多精入卵率則顯著升高。這點和Hao等人[14]的研究結果一致。

2 OPN在雌性哺乳動物生殖上的作用

2.1 輸卵管中的OPN

輸卵管內連子宮，外接卵巢。眾所周知輸卵管在精子獲能、卵子受精、受精卵輸送及早期胚胎發育中發揮著不可替代的作用。哺乳動物受精時，精子和卵子分別從相反的方向進入輸卵管壺腹部，并在此完成受精過程，而在此過程中輸卵管為受精過程提供適宜的環境。受精卵繼續停留在輸卵管內發育分裂，直至子宮內膜及子宮肌層已成熟而變得宜于受精卵著床之時，始由輸卵管進入子宮腔[15]。

輸卵管上皮細胞分泌物、輸卵管血管滲透液、少許的腹腔液和子宮液等等構成了輸卵管管液的主要成分。輸卵管管液促進精子和卵子的進一步成熟、卵子受精、受精卵的早期發育與運輸等過程。根據現有的資料顯示，輸卵管管液中存在著OPN蛋白[16]。Luedtke等人[4]2002年報道稱OPN蛋白在不影響精子活力及存活率的前提下，參與調節精子獲能過程及頂體反應， 從而保證了精子在與卵子接觸前具有正常的受精能力。研究發現一定濃度的OPN蛋白促進精子獲能、卵子受精及早期受精卵的卵裂[17，18]。但到目前為止，仍沒有其他文獻報道，OPN在精子獲能、卵子受精等生理過程中的具體機制。

2.2 OPN參與子宮內膜容受性的建立

子宮內膜容受性是指內膜對胚胎的接受能力。在哺乳動物生殖中，只有處在一定發育階段的胚泡與特定功能狀態的子宮內膜接觸才能植入，而這兩特定的同步階段稱為內膜種植窗。根據生殖醫學資料，內膜種植窗是受精卵定位、黏附和著床的必要條件[19，20]。通過免疫組化法研究發現整合素αvβ3 特異性地表達于內膜 的種植窗， 是目前公認的內膜容受性的標志蛋白。而整合素αvβ3正是OPN蛋白的一種受體。此外子宮內膜基因表達的檢測結果也顯示，子宮內膜植入窗期OPN蛋白的表達量顯著增加[21]。這似乎預示著，OPN蛋白參與了子宮內膜容受性建立的過程。

在人和綿羊體內，OPN是子宮上皮腺分泌物，黏附于上皮細胞表面及孕體滋養層。并且是圍種植入期維持妊娠的關鍵因素。在整個妊娠期，OPN蛋白對于胚胎與胎盤之間的細胞間的黏附、信號傳導、遷移移動具有非常重要的作用。Greg等人[22]研究發現，在綿羊妊娠25～120 d這段時間OPN及其mRNA在綿羊子宮內的表達量發生顯著變化。而在妊娠40～80 d，來源于子宮腺上皮的OPN在子宮內膜上的表達量增長了30倍。此外研究發現，在整個妊娠過程中僅分子質量為45kD的OPN連續大量表達于內膜腺上皮、孕體滋養層以及子宮-胎盤的接觸面上。據目前的研究顯示，45kD OPN在誘導細胞之間相互黏附和細胞遷移上要較其他分子量的OPN作用更強。

2.3 OPN對胚胎著床的作用

妊娠是一個十分復雜的過程，大致可以分為胚胎的著床與胚胎的發育。胚胎的著床過程中，OPN不僅作為細胞因子，還充當黏附因子的作用，對胚胎著床起著至關重要的作用。OPN主要是通過RGD序列與整合素等多種受體結合，參與細胞的黏附和遷移。OPN在哺乳動物的母-胚胎界面持續表達，充當類似于母體胎盤間的介質。雖然具體分子機制目前暫未清楚，但普遍學者認為，OPN在調節胚胎著床等方面的作用不可置否，極可能是胚胎-子宮微環境的重要組成部分，且參與了胎盤的形成過程，而且對于胚胎的發育成熟起著促進作用[23]。另外，在子宮內膜和胚胎上，OPN主要與它的受體αvβ3結合，造成了細胞黏附和遷移行為的開啟。OPN基因及蛋白在早孕小鼠子宮內膜的動態表達規律及在子宮內膜的分布變化暗示了OPN參與胚泡著床的黏附過程。有OPN在妊娠中后期小鼠胎盤的表達和分布提示，OPN可能是影響子宮-胚胎微環境的重要組成部分，參與了胎盤形成，促進了胚胎發育成熟[24]。

總之，OPN在哺乳動物妊娠過程中主要存在以下3方面的作用：首先，在整個孕期，是影響子宮－胚胎界面細胞黏附和信號轉導的組織營養物質的成分；其次是子宮內膜和滋養層細胞表達的產物，引起與胚胎侵襲相關的蛻膜化改變；最后是OPN蛋白長期在子宮和胚胎免疫細胞表達，且調控與其相關功能的細胞因子，促進小鼠胚胎的正常發育，維持妊娠過程[25]。

3 OPN在生豬生產中應用的展望

綜上可知，OPN蛋白無論是在雄性哺乳動物還是雌性哺乳動物的生殖系統中都是普遍存在的，且廣泛參與了整個生殖過程。雖然目前已經有了大量的證據證明這一點，但是其中的大部分的分子機制到目前還不是很清楚。研究OPN蛋白與哺乳動物生殖的關系，在人類醫學方面有助于理解人類受精過程， 有助于提高輔助生殖技術的受精率和妊娠率， 減少并發癥 ( 如多胎妊娠) 發生。

在畜牧學方面，目前有學者認為，高繁殖力公畜與低繁殖力公畜的精液里OPN蛋白含量存在顯著性差異，但目前還沒有直接的證據證明，本實驗室目前正在研究OPN蛋白與公豬繁殖力的相關聯系及其中的具體的分子機制。眾所周知，目前生豬生產中普遍采用人工授精的方式，人工授精這種技術的應用就決定了公豬精液品質對整個生豬生產中起到至關重要作用，它在很大程度上影響了豬場的生產成績。目前在人工授精前，一般豬場會采用肉眼觀察結合顯微鏡下觀察的方式綜合評定精液品質，具體指標有精液的顏色、氣味，以及精子活力，畸形率等。但是即使在這些指標都正常的情況下，各個公豬的生產成績也是參差不齊。目前的資料顯示OPN等蛋白對精卵融合，受精過程中產生至關重要的影響。如果通過實驗驗證，公豬精液中OPN蛋白的含量和公豬的繁殖力有直接的相關性，我們就可以做成一種簡易檢測試劑盒，在豬場人工授精前，通過這種試劑盒檢測精液中OPN蛋白的含量高低，繼而得出該精液品質的好壞。通過這樣的方式，將會極大地提高豬場的生產成績，給生豬生產帶來巨大的經濟效益。

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2015-06-11）

國家杰出青年科學基金。通訊作者：張守全。