結腸息肉癌變過程中內鏡微血管特征與MVD IGF-1 STAT3表達相關性研究*

劉紅 吳靜 林香春 劉揆亮 馬艷會 余瑞金

·臨床研究與應用·

結腸息肉癌變過程中內鏡微血管特征與MVD IGF-1 STAT3表達相關性研究*

劉紅 吳靜 林香春 劉揆亮 馬艷會 余瑞金

目的：分析MVD、IGF-1、STAT3等血管生成因子在結腸癌及癌前病變組織中的表達與窄帶成像內鏡（NBI）下的微血管形態的相關性，探究內鏡實時觀測血管生成的可行性。方法：將普通白光內鏡以及NBI內鏡均診斷為結腸息肉樣病變并經病理組織學證實的結腸早期癌、結腸腺瘤納入研究，將微血管形態分為三型：Ⅰ型：無微血管形態可見；Ⅱ型：微血管沿腺管開口排列，粗細均勻；Ⅲ型：微血管粗細不均，排列紊亂。同時將病變組織進行CD34、IGF-1、STAT3免疫組織化學染色，比較NBI微血管形態特征和組織學結果的相關性。結果：共有58例患者的64個部位（結腸早期癌15個，腺瘤29個，正常黏膜20個）進行NBI內鏡檢查，NBIⅡ型部位以腺瘤為主，占82.1%（23/28），而早癌多表現為Ⅲ型，占66.7%（10/15）。免疫組織化學提示微血管密度（MVD-CD34）、IGF-1在正常黏膜、結腸腺瘤和結腸早癌中的表達有顯著性差異（P<0.000 1，P=0.006 2），STAT3在三者間表達有逐漸增高的趨勢（P=0.071 3）。在NBI微血管形態分型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型組織中MVD-CD34、IGF-1、STAT3的表達均有顯著性差異（P< 0.000 1，P=0.001 0，P=0.005 5）。NBI的微血管類型和MVD、IGF-1、STAT3表達的相關系數分別為0.67、0.41和0.40。結論：根據NBI內鏡實時微血管形態評估組織血管生成，是一項非常有前景的結腸息肉癌變檢測方法。

窄帶成像內鏡 結腸腺瘤 結腸早期癌 微血管形態 腫瘤血管生成

結腸癌在我國發病率日益增高，其發生發展與血管生成有密切的關系，有研究提示腫瘤血管生成開關位于癌前病變階段［1］，測定微血管密度（mi?crovessel density，MVD）是評價血管生成的常用指標，胰島素樣生長因子1（IGF-1）、信號轉錄子與轉錄活化子3（STAT3）等可促進血管生成［2-4］。另一方面，近年內鏡的發展使得內鏡下觀察血管生成成為可能，窄帶成像內鏡（narrow band imaging，NBI）可在內鏡下清晰顯示黏膜表面微血管形態。本研究旨在分析MVD、IGF-1，STAT3等在結腸癌及癌前病變組織中的表達與NBI下的微血管形態的相關性，探究內鏡實時觀測血管生成的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般臨床資料 將2011年8月至2011年12月在首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院消化內鏡室就診，普通白光內鏡以及NBI內鏡均診斷為結腸息肉樣病變并經病理組織學證實的結腸早期癌、結腸腺瘤納入研究，同時將查體患者并結腸鏡檢查陰性的患者納入研究。所有患者均有行內鏡下息肉活檢、高頻電切除或外科手術指征。潰瘍性結腸炎、家族性腺瘤性結腸息肉病、鋸齒狀腺瘤以及進展期結腸癌均除外。所有患者均于內鏡檢查前簽署內鏡檢查知情同意書。本研究已通過首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院倫理委員會批準。

1.1.2 儀器 所有入選病例均行NBI結腸鏡（CFH260，Olympus Corp，Tokyo，Japan）檢查。處理器型號為CV-260SL（Olympus），高清顯示器，分辨率為1280×1024，雙帶NBI過濾器（415 nm和540 nm），有構造強調（A1-A5）和輪廓強調（B1-B5）。

1.2 方法

NBI內鏡檢查前準備同普通結腸鏡檢查。白光模式進鏡至回盲部，通過辨認闌尾孔、Y型盲腸皺襞和回盲瓣結構，以及進鏡至末端小腸證實進鏡到達盲腸。退鏡觀察全結腸，對息肉以NBI模式仔細觀察其表面微血管形態，然后行活檢、EMR、ESD或外科手術切除病變。結腸黏膜正常者在直乙交界處取活檢1塊作為對照。標本用甲醛固定后石蠟包埋，以4 μm厚度連續切片，H&E染色進行組織病理學檢查，同時進行血管內皮細胞標記物CD34、IGF-1、STAT3（一抗購自武漢博士德生物公司）免疫組織化學染色（步驟按說明書進行）。病理學診斷采用WHO診斷標準。組織學由兩位不知內鏡結果的病理醫師分別確診。

1.2.1 免疫組織化學結果判斷 CD34定位于血管內皮細胞包膜和胞質，其標記的微血管密度（MVD）的計數標準參照Weidner等［5］的方法。對IGF-1和

STAT3蛋白染色片進行半定量分析，選取染色均勻的腫瘤區，在400倍視野下計數著色細胞占細胞總數的比例，共計數5個視野，取平均值。以著色細胞占視野細胞總數的比例計為0～3分：無陽性細胞為0分；<25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。

1.2.2 NBI圖像微血管形態的評價 在本研究中，微血管形態分為三型：Ⅰ型：無微血管形態可見；Ⅱ型：微血管沿腺管開口排列，粗細均勻；Ⅲ型：微血管粗細不均，排列紊亂（圖1）。記錄每個息肉在內鏡下微血管類型，并與相應的免疫組化結果對比，分析兩者間的相關性。

圖1 NBI內鏡下微血管形態分型Figure 1 NBI microvascular types

1.3 統計學分析

采用SAS統計分析軟件包（9.10；SAS Institute Inc.，Cary，NC）進行。所有計量資料以x±s表示，P<0.05為有顯著性差異。MVD、IGF-1和STAT3在各組間表達的差異采用單因素方差分析，然后用SNK進行兩兩比較。內鏡分型與病理結果之間的相關性分析采用非參數Spearman's等級相關分析。

2 結果

2.1 一般情況

共有38例患者的44個結腸病變以及正常結腸20個部位納入研究。患者的平均年齡是61.5（30～89）歲，其中男性36例，女性28例。44個病變中包括15個結腸早期癌和29個結腸腺瘤，低級別上皮內瘤變19個，高級別上皮內瘤變10個，管狀腺瘤14個，絨毛管狀腺瘤14個，絨毛狀腺瘤1個；腫瘤平均大小1.44 cm，結腸早期癌1.87 cm，結腸腺癌1.06 cm。病變的組織學類型和內鏡下表現具體見表1。

2.2 病變NBI類型與病理組織學類型的關系

根據NBI分型，64個部位中，I型25個，其中正常部位20個和腺瘤5個；NBIⅡ型28個，包括腺瘤23個和早期癌5個；在11個NBIⅢ型部位中有10個為早期癌部位，1個為腺瘤。結果提示Ⅱ型部位以腺瘤為主，占82.1%（23/28），而早期癌多表現為Ⅲ型，占66.7%（10/15，表2）。

2.3 不同組織中MVD、IGF-1和STAT3的表達

MVD在正常黏膜、結腸腺瘤和結腸早期癌中的表達數分別為8.77±2.67、21.37±4.42和21.33±5.23，前者與后二者之間有顯著性差異（P<0.000 1），在結腸腺瘤和結腸早期癌中無統計學差異（P>0.05），提示MVD在腺瘤中明顯增加。IGF-1在正常黏膜、腺瘤和早期癌中的表達分別為0.50±0.76、0.59±0.68和1.27± 0.80，前二者與后者間有顯著性差異（P=0.006 2），IGF-1在癌組織中表達明顯升高。STAT3在正常黏膜、腺瘤和早期癌中的表達分別為0.40±0.60、0.66± 0.90和1.07±0.96，三者間表達雖有逐漸增高的趨勢，但差異無統計學意義（P=0.071 3）。MVD、IGF-1和STAT3在不同組織中的表達見圖2，表3。

圖2 CD34、IGF-1、STAT3在不同組織中的表達Figure 2 Expression levels of CD34,IGF-1,and STAT3 in colorectal cancer,adenoma,and normal mucosa

表1 結腸病變的組織學類型和內鏡下表現Table 1 Histological type and endoscopic type of colorectal lesions

表2 NBI類型與組織學特性的關系Table 2 Correlation between NBI type and histological findings

2.4 病變微血管特征與組織學MVD計數及IGF-1、STAT3表達的關系

在NBI微血管形態分型中，25個Ⅰ型部位的MVD計數為10.85±5.20，28個Ⅱ型部位為21.46± 4.21，11個Ⅲ型部位為22.09±5.84，三者間有顯著性差異（P<0.000 1）。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型部位的IGF-1表達分別為0.44±0.71、0.68±0.67、1.45±0.82，三者間有顯著性差異（P=0.001 0）。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型部位的STAT3表達分別為0.32±0.57、0.75±0.93、1.27±0.90，三者間有顯著性差異（P=0.005 5）。對NBI的微血管類型與MVD計數行相關性分析，結果顯示Spearman相關系數為0.67，提示兩者之間有相關性，即隨著內鏡下觀察到的血管從無到有，顏色從淺到深，MVD計數有逐漸升高的趨勢。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型與IGF-1、STAT3表達具有相關性，相關系數分別為0.41和0.40。以上結果提示內鏡下血管形態與IGF-1、STAT3表達的相關性較差，內鏡下微血管形態較難反映促血管生成因子IGF-1、STAT3的表達（表4）。

表3 結腸早期癌、腺瘤和正常黏膜中MVD、IGF-1和STAT3的表達Table 3 Expression levels of MVD,IGF-1,and STAT3 in early colorectal carcinoma,adenoma,and normal mucosa

表4 NBI內鏡病變微血管特征與組織學MVD計數及IGF-1、STAT3表達的關系Table 4 Correlation of NBI types with expression levels of MVD,IGF-1,and STAT3

3 討論

血管生成在腫瘤的診斷及治療中有重要作用，并且有研究提示在癌前病變階段有血管生成的突然增加。NBI內鏡技術為體內實時觀察血管生成狀態提供了可能。本研究提示在NBI內鏡下觀察到的結腸息肉微血管形態變化與組織學中檢測到的血管生成指標呈正相關，即隨著內鏡下息肉表面微血管由無到有，顏色由淺到深，對應血管生成由少到多，組織中血管生成因子表達由弱到強，預示在內鏡下可實時觀察病變血管生成狀態的可行性。

NBI內鏡下微血管形態分型與組織學結果有顯著相關性，與前期研究結果相符合［6］。Ⅰ型即內鏡下看不到微血管提示正常結腸黏膜或增生性息肉，Ⅱ型表現為微血管沿腺管開口排列并且粗細均勻，此微血管形態與結腸腺瘤相關［7-8］，微血管粗細不均、排列紊亂的Ⅲ型提示早期結腸癌，此結果與大多數國內外研究結果一致［9-11］。

本研究中，采用CD34標記血管內皮免疫組織化學方法檢測MVD，結果提示結腸腺瘤和結腸早期癌中MVD明顯高于正常黏膜，提示MVD在腺瘤中明顯增加。已有大量研究提示，MVD的增加依賴于血管生成因子的水平［12］，IGF-1是生長調節素的一種，可促進腫瘤血管生成［13］，而STAT3是多種血管生成信號傳導通路的一個重要的交匯點［14-15］。本研究提示IGF-1和STAT3的表達與MVD有相似趨勢，在正常黏膜、腺瘤和早癌中表達逐漸增高。IGF-1在結腸腺瘤中無明顯增加，在早期癌中明顯升高，提示IGF-1在正常黏膜→腺瘤→癌序列中表達與MVD的增加可能有不同步的趨勢，在MVD增加的早期可能有其他促血管生成因子的參與。

在內鏡下微血管形態與血管生成指標關系的研究中，NBI分型為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型的部位之間MVD、IGF-1、STAT3表達均有顯著性差異，NBI的微血管類型和MVD的相關系數為0.67，提示兩者之間有相關性，即隨著內鏡下觀察到的血管從無到有，顏色從淺到深，MVD計數有逐漸升高的趨勢。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型與IGF-1、STAT3表達具有相關性，相關系數分別為0.41和0.40，提示內鏡下微血管形態較難反映促血管生成因子IGF-1、STAT3的表達。由以上結果證明內鏡下觀察到的血管形態可反映組織中微血管密度的狀況，但與IGF-1、STAT3等促血管生成因子的表達相關性稍差。

本研究中未選擇連續的患者入組，因為在常規內鏡檢查的患者中，增生性息肉和管狀低級別瘤變息肉較多，為便于觀察癌變過程中內鏡微血管和組織學變化的關系，本研究中刻意多選擇了部分腺瘤，尤其高級別瘤變者。另外，內鏡微血管形態的變化與選取的促血管生成因子表達相關性稍差，在后續的研究中應尋找其他相關因子，在大樣本中進一步深入研究。

總之，本研究提示用NBI內鏡實時觀察微血管形態評估組織血管生成，是一項非常有前景的檢測方法，提示了內鏡實時觀測血管生成的可行性。

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（2015-03-08收稿）

（2015-04-15修回）

（編輯：楊紅欣）

Correlation of microvascular characteristics under narrow band imaging with MVD,IGF-1,and STAT3 expression during cancerization of colorectal polyp

Hong LIU,Jing WU,Xiangchun LIN,Kuiliang LIU,Yanhui MA,Ruijin YU
Department of Gastroenterology,Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University,Beijing 100038,China
This work was supported by funds from the Health System"215"Training Program of High-level Talents in Beijing and Beijing Municipal Project of Health Technical Personnel Training(No.2011D003034000009)

Jing WU;E-mail:wujing36@163.com

Objective:To investigate the correlation between the expression of angiogenic factors(MVD,IGF-1,and STAT3)in colorectal carcinoma and adenoma and the microvascular characteristics under narrow band imaging(NBI),in order to evaluate the feasibility of NBI in real-time observation of angiogenesis.Methods:Patients with pathologically confirmed colorectal polyps were recruited and examined by NBI.Vascular patterns were classified into typeⅠ(invisible or faintly visible),typeⅡ(clearly visible and regularly arranged in a round,oval honeycomb-like pattern),and typeⅢ(clearly visible and irregularly arranged in terms of size and caliber or irregularly winded).Immunohistochemical staining was performed to determine the expression of CD34,IGF-1,and STAT3. Histological results were compared with the vascular patterns under NBI.Results:The NBI endoscopy results of 64 sites(15 adenocarcinomas,29 adenomas,and 20 normal tissues)from 58 patients were introduced and examined in this study.Adenomas ranked the first (82.1%,23/28)among the vascular patternⅡcases,whereas early adenocarcinomas dominated the vascular patternⅢcases(66.7%, 10/15).The expression levels of MVD-CD34 and IGF-1 in normal mucosa,adenomas,and adenocarcinomas were significantly different(P<0.0001 and P=0.0062,respectively).All the expression levels of MVD-CD34,IGF-1,and STAT3 in sites displaying vascular patternsⅠ,Ⅱ,andⅢwere significantly different(P<0.0001,P=0.0010,and P=0.0055,respectively).Spearman correlation coefficients between the NBI vascular patterns and the MVD-CD34,IGF-1,and STAT3 expression levels were 0.67,0.41,and 0.40,respectively. Conclusion:Vascular pattern analysis through an NBI system can be a promising tool to evaluate angiogenesis of colorectal lesions in real-time endoscopic observation.

narrow band imaging,colorectal adenoma,early colorectal carcinoma,microvascular pattern,tumor angiogenesis

10.3969/j.issn.1000-8179.20150270

首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院消化科（北京市100038）

*本文課題受北京市高層次人才（215）培養項目、北京市優秀人才培養項目（編號：2011D003034000009）資助

吳靜 wujing36@163.com

劉紅 專業方向為消化道早期腫瘤的內鏡診斷及相關基礎研究。

E-mail：wujing36@163.com