乙型肝炎病毒DNA定量檢測的臨床應用

賈紅龍

乙型肝炎病毒DNA定量檢測的臨床應用

賈紅龍①

目的：探討乙型肝炎患者HBV-DNA含量與其乙型肝炎血清學標志物的關系。方法：采用微板核酸雜交技術對200例乙型肝炎血清學標志物陽性的患者和20例正常健康人群，進行HBV-DNA PCR定量檢測。結果：根據血清學標志物分為五組，HBsAg、HBeAg、抗-HBc均陽性患者HBV-DNA含量高于其他患者，比較差異有統計學意義（P＜0.05），HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均陽性患者與HBsAg、抗-HBc均陽性患者DNA拷貝數比較差異無統計學意義。結論：乙肝血清學標志物作為乙肝病毒有無感染的指標不能完全反映患者體內HBV的復制情況，HBV-DNA定量檢測對監測乙肝病毒感染的病情發展及抗HBV復制藥物的治療具有重要意義。

乙型肝炎病毒； 微板核酸雜交； 血清學標志物

我國是世界上乙型肝炎病毒感染的高發地區，全國約有50％～70％的人感染過乙型肝炎病毒，約10％的人為攜帶者。目前我國對乙型肝炎病毒感染的診斷主要依賴于血清特異抗原/抗體的檢測。聚合酶鏈反應（PCR）因其特有的高特異性、高靈敏度在臨床檢測中得到廣泛的應用。筆者采用微板核酸雜交法檢測乙肝患者血清HBV-DNA含量，以探討乙肝患者病毒復制與乙肝病毒標志物之間的關系及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗組為2010年1-12月來本院就診的患者，共200例，全部病例均為HBV血清學標志物陽性患者，年齡25～75歲，其中男148例，女52例。對照組選擇20例體格檢查后HBV血清學標志物全陰性、肝功能正常者，其中男10例，女10例。血清采用經高壓滅菌的0.5 mL Eppendorf管分裝于4 ℃保存，3 d內檢測完畢。

1.2 試劑及儀器 試劑：HBV微板核酸雜交定量檢測試劑盒（上海浩源生物科技有限公司提供），HBV血清學標志物檢測試劑盒（上海科華公司提供）。儀器：PCR擴增儀（英國TECHNE-GENIUS PCR擴增儀），酶標儀（奧地利產SLT-SPECTRA型酶標儀）。

1.3 方法

1.3.1 反應原理 通過裂解液裂解釋放DNA，去除雜蛋白，合成兩段與目的序列的兩端分別互補并標有生物素標記的寡核苷酸引物，在此反應中，生物素標記的引物結合上靶序列，在DNA聚合酶催化下，利用反應體系中的游離核苷酸（dDNA），從5’→3’方向延伸DNA鏈。產生與靶序列互補的鏈稱為擴增產物。在微孔板中事先包被通用捕集探針，再與接頭液分子（一頭與板上通用探針互補，另一頭與擴增產物互補的特異結合的捕獲探針）結合，接頭分子捕獲擴增產物后，擴增產物上標記的生物素能與親和素-辣根過氧化物酶結合，通過TMB顯色，酶標儀讀數。

1.3.2 檢測方法 試劑準備：分裝PCR主反應液、裂解液、稀釋液。標本制備：加入50 μL標本到裂解液（50 μL）中，于37 ℃保溫箱保溫1 h，加入100 μL中和液，用樣品稀釋液A稀釋，使成為樣品原液。再用樣品稀釋液B稀釋樣品原液，取稀釋后的樣品15 μL加入到盛有主反應液的反應管中。加入50 μL石蠟油.

1.3.3 標本檢測 將處理后的標本進行擴增、雜交，雜交后用TMB系統進行顯色，酶標儀讀取讀數，定量計算。計算公式拷貝/mL

A：吸光度值（λ=450 nm）；S：陰性對照值；B：PCR前血樣稀釋倍數；T：PCR后產物稀釋倍數。

1.4 統計學處理 根據血清學標志物分組，對各組間DNA拷貝數的比較，所有統計數據使用SAS 6.12統計分析軟件，采用單因素方差分析，計量數據采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

HBsAg、HBeAg、抗-HBc均陽性患者HBV-DNA含量高于其他患者，比較差異有統計學意義（P＜0.001）；HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均陽性患者與HBsAg、抗-HBc均陽性患者DNA拷貝數比較差異無統計學意義。見表1。

表1 200例乙肝患者血清HBV-DNA含量與其血清標志物的關系

3 討論

定量測定血清中的HBV-DNA可用于監測乙肝病毒復制狀況，從早期的斑點雜交法、bDNA、到競爭性PCR、PCR-ELISA，至現在的微板核酸雜交定量法等，均為了能準確對患者血清中HBV-DNA進行定量和研究，本文通過微板核酸雜交技術對HBV-DNA定量研究其與不同血清學標志物的關系及意義[1-4]。

3.1 HBsAg、HBeAg、抗-HBc陽性 本組為乙肝病毒感染期的標志，該組HBV-DNA檢出率高達98.5％，且DNA拷貝數為3.3×107拷貝/mL，說明該組患者乙肝病毒復制最為活躍，提示該類型患者傳染性強。這與臨床上觀察到該類型患者的病情如肝功能反復損害等變化是一致的[5-6]。實驗中發現有2例服用拉米夫定的患者，其治療過程中病毒復制已被抑制，DNA拷貝陰性，但在短暫的時間內血清標志物的轉換還未完成。

3.2 HBsAg、抗-HBe、抗-HBc陽性 本組為長期乙肝病毒攜帶標志，其HBV-DNA拷貝數為7.9×105拷貝/mL，說明病毒復制仍較為活躍。經統計學處理，其DNA拷貝數與HBsAg、HBeAg、抗-HBc患者差異有顯著統計學意義（P＜0.001）。本組HBeAg轉陰，抗-HBe出現，說明人體對乙肝病毒產生免疫應答，但e抗體出現并不能說明病毒復制停止，而只是復制水平降低而已[7]。有文獻報道，當HBeAg轉陰而抗-HBe作為免疫應答出現時，由于存在著乙肝病毒前C區變異，因而HBV-DNA檢測仍保持較高的檢出率[8-9]。這在本文的資料中得以證實。

3.3 HBsAg、抗-HBc陽性 結果顯示HBsAg與抗-HBc均陽性的患者血清HBV-DNA含量7.2×105拷貝/mL，明顯低于HBsAg、HBeAg、抗-HBc均陽性患者，說明復制水平較低，傳染性較后者弱。本次研究發現雖然本組乙肝病毒e抗原/抗體系統全部轉陰，但其DNA拷貝數與HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均陽性患者差異無統計學意義，目前認為是處于HBV感染恢復期或HBV基因突變[10-11]，由于本組資料較少，有待進一步研究。

1999年Makoto[12]報道一些患者和健康攜帶者出現抗-HBe的同時可檢測到持續高滴度的與前C區/C區突變相關的HBV復制。同年Klaw等[13]報道發現一位62歲女患者乙肝表面抗原的新的缺失突變。這些均顯示出乙肝五項檢測與HBV-DNA定性已無法滿足患者或病毒的多型性，而PCR定量方法則能檢測HBV病毒自身[14]，更準確靈敏地反應了HBV的感染和治療恢復情況[15-16]。研究表明，血清中HBV的數量與干擾素的療效有一定相關性。治療前HBV-DNA＜100 pg/mL者中50％有效，而＞200 pg/mL者中只有7％有效[17]。近年來，臨床上出現了拉米夫定等抗病毒藥物，目前關于該藥的臨床療效與抗病毒作用，國內外普遍采用PCR定量技術對其進行監測。

乙肝血清學標志物作為乙肝病毒有無感染的一般性檢測不能完全反映患者體內HBV的復制情況，HBVDNA定量檢測對監測乙肝病毒感染的病情發展及抗HBV復制藥物的治療具有重要意義。可以預見，隨著分子診斷概念和技術的發展與推廣，HBV-DNA定量在乙肝的治療方案選擇和療效考察方面必將有廣泛的應用前景。

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Quantitative Detection of Hepatitis B Virus and Clinical Application/

J IA Hong-long.//Medical Innovation of China，2015，12（11）：110-112

Objective：To investigate the relation between the amount of HBV-DNA in serum of patients with HBV infection and the marker of hepatitis B virus.Method：Serum HBV-DNA was quantitatively detected by tiny plank nucleic acid hybridize technique of PCR to 200 policlinic patients infected with HBV and 20 healthy men.Result：The men were divided into 5 groups with the marker of HBV， there were significance differences from student test between HBsAg， HBeAg， HBcAb masculine and others.Conclusion：It is as index that the marker of HBV monitor hepatitis Bvirus infection， which couldn’t reflect completely replication of HBV.Quantitative detection of HBV-DNA had important significance to moniter the state of HBV infection and drug treatment.

Hepatitis B virus； Tiny plank nucleic acid hybridize； Marker of serum hepatitis B virus

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.11.038

2014-11-28） （本文編輯：王宇）

①沈陽急救中心 遼寧 沈陽 110006

賈紅龍

First-author’s address：Shenyang Emergency Center， Shenyang 110006， China