神經(jīng)干細(xì)胞移植減輕ICH模型大鼠的神經(jīng)功能障礙

祁 景 劉小軍 周明鍇

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU 鄭州 450014

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾?。?］。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞替代、旁分泌腦源性生長(zhǎng)因子和促進(jìn)突觸再生的角度，探討神經(jīng)干細(xì)胞（neural sfem celle，NSCS）移植改善腦出血大鼠神經(jīng)功能的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作 動(dòng)物的飼養(yǎng)和后續(xù)所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。SD大鼠由河南省動(dòng)物中心提供。隨機(jī)選取雄性SD大鼠30只，分為3組：sham組（采用立體定位儀定位穿刺但不打入膠原酶）10只，ICH模型組（模型組，采用立體定位儀定位穿刺并打入膠原酶并鑒定合格）10只，NSCS細(xì)胞干預(yù)組（NSCS組，采用立體定位儀定位穿刺并鑒定合格后注射NSCS 1×106）10只，參照文獻(xiàn)［2］及George Paxinos大鼠腦立體定位圖譜，將大鼠取俯臥位，采用固定器，固定在大鼠腦立體定位儀上，以左側(cè)紋狀體為穿刺點(diǎn)（前囟后0.2mm，左側(cè)旁3mm，垂直6 mm）。采用10μL微量進(jìn)樣器，在該穿刺點(diǎn)緩慢注入0.5μLⅦ型膠原酶溶液（sigma公司），留針約10min后緩慢退出穿刺針。術(shù)后清潔創(chuàng)面，縫合頭皮。術(shù)后24h內(nèi)進(jìn)行mNSS評(píng)分［3］，選取8～12分為符合標(biāo)準(zhǔn)納入分組內(nèi)。

1.2 NSCS的培養(yǎng) 復(fù)蘇NSCS（本實(shí)驗(yàn)室保存），給復(fù)蘇的NSCS每天更換細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM／F12，20%KSR，1mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ巰基乙醇，0.1mM NEAA，10ng／mL bFGF），長(zhǎng)至可以傳代。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)分 采用mNSS評(píng)分（包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡、反射）評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能缺損和恢復(fù)情況，各組均在術(shù)后1、3、7、14、28d評(píng)分。

1.4 腦組織取材 造模后28d提取各組大鼠腦組織標(biāo)本，3～5只多聚甲醛灌注固定法固定腦組織，梯度蔗糖脫水后冰凍冠狀切片（厚12μm）。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 各組切片做brdu（抗體均購(gòu)自santa，一抗為鼠抗人，二抗為兔抗鼠）的免疫熒光染色，和BDNF和GAP-43（抗體均購(gòu)自santa，一抗為兔抗鼠，二抗為山羊抗兔）的免疫組織化學(xué)染色。免疫組化采用imageJ進(jìn)行陽(yáng)性信號(hào)灰度值的測(cè)定分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，其中mNSS數(shù)據(jù)行重復(fù)測(cè)量分析，其余資料行單因素方差分析并行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分結(jié)果，第14天起，各時(shí)間點(diǎn)NSCS組的評(píng)分明顯優(yōu)于模型組、假手術(shù)組（P＜0.05）

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 立體定向注射膠原酶誘導(dǎo)大鼠腦出血后，大鼠迅速出現(xiàn)出血、對(duì)側(cè)偏癱等神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，癥狀體征于術(shù)后1～3d達(dá)高峰，隨后逐漸恢復(fù)。NSCS組較模型組后14d及28d的mNSS評(píng)分且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 Brdu免疫熒光染色 熒光顯微鏡下可見(jiàn)Brdu免疫熒光染色陽(yáng)性的細(xì)胞明顯聚集分布于血腫周圍，血腫對(duì)側(cè)僅可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞散在分布。見(jiàn)圖2。

圖2 綠色免疫染色為陽(yáng)性，A為血腫周圍，B為血腫對(duì)側(cè)腦區(qū)（200×）

2.3 BDNF表達(dá)上升 BDNF在3組中均有表達(dá)，且在血腫周圍的表達(dá)量較高。免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞胞漿被染為棕褐色或棕黃色顆粒狀，陰性者除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，無(wú)棕黃色反應(yīng)物。BDNF在假手術(shù)組，模型組僅可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞，NSCS組較兩者增多。結(jié)果顯示，NSCS組高于組模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

2.4 GAP-43表達(dá)上升 GAP-43在各組中也均有表達(dá)，GAP-43在NSCS組較假手術(shù)組與模型組表達(dá)增多見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示NSCS組與假手術(shù)組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

腦出血引起的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重威脅人類健康和影響生活質(zhì)量。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞其衍生物成為人類神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病——腦出血富有應(yīng)用前景的治療選擇之一［4］。

本實(shí)驗(yàn)NSCS干預(yù)組第14天及第28天其神經(jīng)功能評(píng)分顯著優(yōu)于模型組。從行為學(xué)上表明NSCS移植在腦出血模型中具有確實(shí)的治療作用。

BDNF是一類多功能的多肽生長(zhǎng)因子，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、分化，以及軸突導(dǎo)向和突觸的功能［5］。BDNF激活高親和力受體TrkB后有助于神經(jīng)存活，還具有調(diào)節(jié)突觸的結(jié)構(gòu)和數(shù)量、促進(jìn)新形成突觸的發(fā)育和成熟、促進(jìn)樹(shù)突棘和軸突的生長(zhǎng)等作用。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)到BDNF分泌增多，證實(shí)了NSCS分化的細(xì)胞具有促進(jìn)旁分泌的功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)立體定位向ICH大鼠移植NSCS，NSCS可促進(jìn)BDNF的表達(dá)增多。

GAP-43是一種廣泛分布在神經(jīng)系統(tǒng)中的胞膜磷酸蛋白質(zhì)［6］。GAP-43是可以促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個(gè)重要的內(nèi)在決定因子，它是由神經(jīng)元包體合成，與神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)密切相關(guān)，在神經(jīng)元發(fā)育和再生過(guò)程中，作為神經(jīng)元的損傷、修復(fù)及再生的重要分子標(biāo)志物，隨著神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)大量合成［7］。BDNF能夠促進(jìn)軸突生長(zhǎng)錐表面GAP-43和軸突骨架蛋白β-tublin表達(dá)的上調(diào)從而促進(jìn)軸突的延伸［8］。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，NSCS的移植能夠改善局部的微環(huán)境、上調(diào)BDNF并啟動(dòng)再生相關(guān)GAP-43的表達(dá)增多，進(jìn)而促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。總之，我們以腦出血模型大鼠為研究對(duì)象，采用ICH患者來(lái)源的NSCS進(jìn)行移植治療。結(jié)果表明NSCS移植能有效改善ICH模型大鼠的神經(jīng)功能障礙，其機(jī)制為細(xì)胞替代、旁分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和促進(jìn)軸突再生等多個(gè)方面。

圖3 BDNF免疫組化染色，A假手術(shù)組，B模型組，NSCS組（400×）

圖4 GAP-43免疫組化染色，A假手術(shù)組，B模型組，NSCS組（400×）

圖5 BDNF及GAP-43免疫組化的灰度值，各組均為陽(yáng)性，但NSCS組較假手術(shù)組、模型組灰度值均增多（P＜0.05）

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