水通道蛋白AQP9在帕金森病腦組織中的表達及作用

余玉銀唐省三李方成汪 凌梁淑燕程 彥

1）廣東同江醫院神經外科 佛山 528300 2）廣東食品藥品職業學院護理學院 廣州 510520 3）中山大學第二附屬醫院神經外科 廣州 510120 4）廣東佛山市順德區大良醫院 佛山 528300

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是最常見的運動障礙且與老化相關的神經退行性疾病之一。約2%的60歲以上老人罹患此病，主要臨床表現是運動障礙（運動遲緩、震顫、姿勢不穩、僵直）與非運動相關癥狀（嗅覺缺失、自主反應失調、認知缺陷、抑郁和睡眠障礙）。有研究顯示，水通道蛋白（Aquaporin，AQP）9即AQP9參與了機體能量代謝及水電解質調節［1-2］。目前，鮮有文獻報道帕金森病腦組織中AQP9的表達變化以及其對帕金森病的影響。因此，本研究旨在通過建立大鼠帕金森病模型，運用RT-PCR技術和免疫組織化學（immunohistochemistry，IH）等實驗方法，研究帕金森病大鼠腦組織中AQP9表達的變化情況，分析帕金森病不同階段中AQP9表達所發揮的作用，探索新的臨床治療帕金森病的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取成年廣東省醫學實驗動物中心提供的64只Wistar大鼠，雄性，體質量200～250g。動物分為正常組（n＝10）、假手術組（n＝27）和帕金森病組（n＝27）。假手術組和帕金森病組分別于術后1、2、3、4、5、6、8、10和12周取材。每一時間點，分別用IH及RT-PCR法檢測帕金森病組和假手術組大鼠3只。

1.2 PD大鼠模型制作及入選標準

1.2.1 PD大鼠模型制作：大鼠稱重并記錄后，向大鼠注射6%水合氯醛進行麻醉；將大鼠固定在立體定位儀上，經常規碘酒和酒精消毒后，取頭部正中矢狀位切開皮膚與皮下組織至顱骨。按照包新民等研究的大鼠腦圖譜確定黑質及黑質紋狀體通路注射坐標位點，將新鮮配制的6-OHDA溶液4μL（6-OHDA含量為12μg）通過微量注射器緩慢勻速地注射到大鼠腦內，退出微量注射器后立即縫合切口。動物蘇醒后，予以食水，送回動物飼養室。假手術組大鼠除不注射藥物6-OHDA外，其余操作同帕金森病組。

1.2.2 PD大鼠模型行為學檢測：大鼠術后1周，在注射6-OHDA的大鼠腹腔內注射鹽酸阿撲嗎啡（5mL／kg），注射后5min后，觀察大鼠向對側旋轉的情況并使用大鼠帕金森病模型旋轉檢測儀予以記錄，連續記錄60min，旋轉標準為：大鼠向注射藥物的對側不改變方向地旋轉360°為旋轉1次。上述操作每周1次，連續檢測12周。PD大鼠模型制作成功標準為：大鼠平均旋轉次數≥7次／min。假手術組大鼠未出現明顯的神經功能障礙。

1.3 實驗方法

1.3.1 制作腦組織切片：麻醉受試大鼠，生理鹽水心臟灌注后，斷頭取腦組織并立即進行冰凍切片，按照厚約10μm／片標準 連續切片，晾干后做常規HE和IHC染色。

1.3.2 IHC檢測AQP9的表達變化：切片洗片后，按照SAP-9100（中杉金橋）免疫組化試劑盒的說明完成操作。使用水溶性封片劑進行封片，并在光學顯微鏡下進行觀察及拍照。陰性對照組采用0.01mol／L PBS緩沖液代替一抗，其余步驟與實驗組相同。

1.3.3 RT-PCR檢測AQP9mRNA含量的變化：對實驗大鼠進行麻醉，心臟灌注冰生理鹽水后斷頭取腦，選取帕金森組大鼠50mg病灶周圍腦組織，同時選取假手術組與正常組大鼠相應部位50mg腦組織。按照Trizol試劑說明書（Takara公司生產）提取各受試大鼠的腦組織RNA，用紫外分光光度儀進行檢測。mRNA逆轉錄為cDNA依照杭州博日AMV逆轉錄試劑盒的操作說明進行。用AQP9（165bp）上游5′-gaaggacggtgccaagaag-3′，下游5′-gtgatgatcccgccaaaac-3′；B-actin（398bp）上 游5′-ctgccgcatcctcttcctc-3′，下 游5′-ctcctgcttg ctgatccacat-3′引物對AQP9及β-actin的cDNA進行擴增，PCR產物含量采用2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，其結果通過紫外分析儀進行觀察并照相。

1.3.4 圖像分析：在免光鏡下分析疫組化結果，使用北航CM-2000B型生物醫學圖像分析系統對隨機選取的同一部位切片10個不同視野進行自動分析，細胞平均灰度值表示其結果；RT-PCR結果采用Bandscan5.0分析軟件進行密度分析，AQP9mRNA的表達水平計算公式為：AQP9mRNA含量＝AQP9光密度值／β-actin光密度值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0進行統計分析，計量資料以（±s）表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織病理變化 選取的腦組織切片經Nissl染色，帕金森病組成功模型鼠左側黑質致密部（SNC）及中腦腹側被蓋區（VTA）區可見到神經元數目明顯減少，顆粒密度減少，內氏體模糊，伴有少量反應性膠質細胞增生，損毀范圍以注射點為中心向周邊擴散，在靠近前囟后5.2mm的切片上顯示SNC區損毀面積達1.87mm×0.26mm，占SNC總面積的94%，右側SNC及VTA區神經元未見明顯減少，顆粒密度分布正常，內氏體清晰。而正常組及假手術組雙側SNC及VTA區神經元數目未見異常。

2.2 AQP9在不同組別中表達比較 IHC結果顯示，正常組雙側大腦皮質、下丘腦、海馬、左側黑質致密部（SNC）及中腦腹側被蓋區（VTA）區AQP9表達呈弱陽性，假手術組各時段與正常組基本一致，但帕金森病組AQP9表達則呈現動態性變化過程：術后1周，病灶側大腦皮質、海馬、左側黑質致密部（SNC）及中腦腹側被蓋區（VTA）區、室管膜、脈絡叢、下丘腦室旁核和視上核AQP9表達較假手術組強，差異存在顯著性（P＜0.05）；術后2～5周，帕金森病組AQP9表達逐漸降低，至4周降至最低，均低于同一時點假手術組AQP9表達水平（P＜0.05），僅脈絡叢可見較強表達；6周后雙側大腦AQP9廣泛表達，AQP9表達在黑質致密部及中腦腹側被蓋區、大腦皮質、脈絡膜、雙側室管膜、穹窿下器等腦室周圍器官、背側丘腦、海馬、病灶中心區及周圍組織、下丘腦室旁核、視上核等部位均可見，8周尤為明顯，顯著高于同一時點假手術組AQP9表達水平（P＜0.05）；隨后AQP9表達量呈現下降趨勢，但于12周時，其表達水平仍明顯高于假手術組（P＜0.05），詳見圖1。

圖1 帕金森病腦組織中AQP9的表達變化

2.3 各組AQP9mRNA含量變化 正常組、假手術組和帕金森病組大鼠病灶周圍腦組織是本實驗AQP9mRNA含量的檢測對象。RT-PCR結果顯示：假手術組AQP9mRNA含量與正常組比較，差異無顯著性；帕金森病組AQP9mRNA的表達則呈現動態性變化過程：術后1周，帕金森病組大鼠腦組織AQP9mRNA含量已明顯高于假手術組含量（P＜0.05）；隨后，該組AQP9mRNA含量呈逐漸下降趨勢，于4周時降至最低值，明顯低于同一時點假手術組AQP9mRNA表達水平（P＜0.05）；之后，AQP9mRNA含量又逐漸升高，自術后5～12周各時段，AQP9mRNA含量均明顯高于假手術組（P＜0.05），并于8周達到峰值，隨后呈現下降趨勢，但12周時，AQP9mRNA含量仍明顯高于假手術組（P＜0.05），詳見圖2。

圖2 帕金森病腦組織中AQP9mRNA的表達變化（RT-PCR）

3 討論

水通道蛋白即水孔蛋白，是一組與水通透有關的細胞膜轉運蛋白。自1988年發現第一個水通道蛋白后，從哺乳動物組織內相繼分離克隆出至少13種AQP［3］。目前，在腦組織中發現6種AQP蛋白，它們分別是AQP1、3、4、5、8和9［4］。AQP9作為水通道蛋白一種特殊亞型，具有廣泛通透性，既具有水通透性，還對多元醇、尿素、嘧嘌呤City、啶類、單羧基類等中性溶質以及類金屬物質都具有很好的轉運活性［5-6］。脂肪組織中最早發現AQP9的存在，隨后在白細胞、肝臟、睪丸、腦和脾等組織中也有發現［7］。目前對AQP9在腦組織的認識尚處于起步階段，鮮見相關報道。

學術界一直認為PD發病與環境因素密切相關，特別是環境中一些殺蟲劑、除草劑以及銅、錳、鉛等金屬元素可能導致PD的發生。研究發現腦多巴胺神經元線粒體內膜上AQP9呈現陽性表達［8］，中毒的主要靶點在線粒體，AQP9在腦組織中不僅與維持水代謝平衡有關，而且在能量代謝方面發揮著重要作用［9］，因此推測AQP9可能與PD發病有一定的關聯，但目前尚缺乏對兩者相關性及作用機制的明確認識。

本實驗使用大鼠腦圖譜確定黑質及黑質紋狀體通路注射位點坐標方法制造帕金森病模型。帕金森病組腦組織切片經Nissl染色，可見帕金森病組成功模型鼠左側黑質致密部（SNC）與中腦腹側被蓋區（VTA）區神經元數目明顯減少，顆粒密度減少，內氏體模糊，伴少量反應性膠質細胞增生，說明帕金森病動物模型制造成功。本研究發現，帕金森病組AQP9和AQP9mRNA的表達則呈一動態性變化過程：術后1周，AQP9強表達于病灶側大腦皮質、海馬、左側黑質致密部（SNC）及中腦腹側被蓋區（VTA）區、脈絡叢、室管膜、下丘腦視上核及室旁核（P＜0.05）；術后2～5周，AQP9表達呈現逐漸下降趨勢，至4周時其值達到最低，均低于同一時點假手術組AQP9表達水平（P＜0.05），僅脈絡叢可見較強表達；6周后雙側大腦廣泛表達AQP9，8周尤為明顯，顯著高于同一時點假手術組AQP9表達水平（P＜0.05）；隨后AQP9表達呈現減弱趨勢，但于12周時，其表達水平仍明顯高于假手術組（P＜0.05）。由此推測，此期高表達的AQP9，主要通過調節水電解質和能量代謝，從而在帕金森病發病機制中起重要作用。

綜上所述，術后2周帕金森病組出現AQP9及其mRNA表達降低現象，在細胞間液急劇增加的情況下，通過延遲形成細胞內水腫，發揮保護膠質細胞的作用；隨后，AQP9及其mRNA表達呈現上調趨勢，提示可能與機體出現水電解質平衡和能量代謝失調有關。目前，醫學界對帕金森病鼠腦AQP9研究還處于初始階段，相關調控機制的研究還需要進一步探索。

［1］Rojek AM，Skow ronskiM T，Fuchtbauer EM，et al.Defective glycerol metabolism in aquaporin 9（AQP9）knockout mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（9）：3 609-3 614.

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［5］Badaut J，Brunet JF，Regli L.Aquaporins in the brain：from aqueduct to"multi-duct"［J］.Metab Brain Dis，2007，22（3-4）：251-263.

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